基于亲合力的细胞外相互作用筛选（AVEXIS）用于可扩展检测低亲和力细胞外受体-配体相互作用

本实验的总体目标是发现参与细胞识别过程的新型细胞外蛋白质相互作用，特别是膜嵌入型受体蛋白。AveXis 方法旨在克服此类蛋白质相互作用通常具有的极弱结合亲和力，以及膜蛋白在生物化学操作上的困难。该方法首先构建细胞表面受体胞外区域的重组蛋白文库来实现这一目标。

通过设计表达质粒，使受体的胞外结构域区域以可溶性片段的形式表达，分别作为单体生物素化诱饵和五聚体酶标记的捕获物。第二步是表达并标准化待测蛋白质，使其准备好用于相互作用筛选。所有蛋白质均在哺乳动物细胞中表达，以确保添加二硫键、糖基化等翻译后修饰。

该实验方案中的一个关键步骤是确保文库中的诱饵蛋白和猎物蛋白均被归一化至阈值水平以内。接下来是激动人心的部分——筛选新的相互作用。将诱饵蛋白分配至微孔板的各个孔中，然后利用猎物蛋白探针检测相互作用。

然后进行洗涤步骤。最后一步是加入酶的底物，以检测捕获到的猎物蛋白阵列上是否存在结合的靶标蛋白。最终，VEX 筛选的结果可以显示哪些细胞表面受体能够形成结合伴侣，因而可能参与细胞间的识别与通讯过程。

该技术相较于常用的蛋白质提取方法（如酵母双杂交或生化纯化）的主要优势在于，它专为检测细胞外蛋白质-蛋白质相互作用而设计。该方法特别适用于发现膜锚定受体蛋白之间的新相互作用。由于膜蛋白在生化操作上较为困难，且其对应的受体相互作用通常极为微弱，因此使用其他技术难以检测到这类相互作用。

该方法有助于解答有关细胞如何相互识别和通讯的关键问题。在分子水平上，可用于探究基本的生物学过程，例如卵细胞和精子表面展示的哪些受体蛋白发生相互结合，或哪些受体-配体相互作用介导了心肌细胞融合或神经嵴形成等细胞行为。该方法的主要挑战在于构建用于筛选相互作用的诱饵蛋白和猎物蛋白文库。

确保诱饵蛋白和猎物蛋白在检测所需的阈值水平内进行标准化也极为重要。这可以减少假阴性和假阳性结果的频率。我最初在攻读博士学位期间萌生了该方法的想法，当时我正试图鉴定 CD 200 细胞表面蛋白的一个结合伴侣。

本质上，我提出的问题是：这种特定的细胞表面受体的结合模式是什么？即使在今天，这仍然是一个在技术上难以回答的问题。然而，当时人类基因组计划即将完成，我意识到，由于我们现在拥有了基因组中所有细胞表面受体的完整列表，因此可以转而在这个受体蛋白集合中，探讨哪些在技术上能够发生相互作用。

这是一个更容易回答的问题，AveXis 正是我们为回答该问题而开发的方法。一旦建立了诱饵蛋白和猎物蛋白表达载体的文库，即可准备将其转染至 HEC 293E 细胞中。首先在转染前一天以每毫升 250,000 个细胞的密度，将细胞接种于 50 毫升 FreeStyle 293 培养基中，以确保高效的生物素化。在用于表达诱饵蛋白（而非猎物蛋白）的培养基中添加 D-生物素。待所有培养板准备完毕后，在标准条件下将细胞培养过夜。

由于生物素溶解度低且需精确配制溶液，我们更倾向于称取额外的生物素，然后加入培养基中，并在次日剧烈振荡。转染50毫升培养细胞，使用适当的转染试剂将25微克诱饵或猎物质粒导入细胞，以产生生物素标记的诱饵；同时共转染诱饵质粒与编码分泌型ELI蛋白生物素连接酶的质粒，比例为10:1，随后进行收获。

转染后第五天，通过以下两步处理培养物：首先将细胞在3000 × g离心20分钟进行收集，其次将上清液S通过0.22微米滤膜过滤。AveXis的一个关键特征是，由于重组蛋白被分泌出来，因此可将其稀释或浓缩至阈值活性范围内。我们发现重组蛋白的表达量差异可达四个数量级，因此归一化步骤可减少筛选过程中假阳性结果的出现。

开始诱饵蛋白的标准化之前，必须通过透析去除培养基中未结合的游离生物素，因为它会与生物素化的诱饵蛋白竞争结合链霉亲和素（streptavidin）的结合位点。首先将诱饵蛋白置于透析袋中。为了确保重组蛋白的有效透析，我们发现为透析管提供足够的表面积至关重要。通常，我们使用的透析管长度为实际所需体积的两到三倍。

在24小时内，透析后用适当的缓冲液（如PBS）对诱饵蛋白进行充分透析。ELIZA实验首先用含BSA的PBST缓冲液在链霉亲和素编码的微孔板中封闭孔板，孵育15分钟。同时，在另一块干净的孔板上，用含2% BSA的PBST缓冲液对诱饵蛋白进行连续四倍的一比三稀释。

孵育15分钟后，将稀释液转移至编码strep TTR的孔板中，在室温下孵育1小时。孵育结束后，洗涤各孔，然后向每个孔中加入100微升浓度为每毫升2微克的OX 68。再次于室温孵育1小时。第二次孵育结束后，进行另一次洗涤步骤，随后加入抗-US碱性磷酸酶。

将培养板在室温下继续孵育第三个小时。随后用 PBST 洗涤培养板三次，并用 PBS 进行最后一次洗涤。为去除任何残留的去垢剂，在一小时后加入 100 微升浓度为每毫升 1 毫克的底物 1 0 4，溶于二乙醇胺缓冲液中。

在室温下测定 405 纳米处的吸光度。使用抗 CD4 标签单克隆抗体通过 ELISA 检测四种不同透析后的诱饵上清液的系列稀释样品。如果未稀释的表达诱饵蛋白不足以饱和链霉亲和素包被板上的所有生物素结合位点，则使用 Viva spin 浓缩器浓缩蛋白。否则，将诱饵蛋白用含 2% BSA 的 PBST 稀释后使用。

这足以饱和检测中生物素的结合位点。利用β-内酰胺酶活性定量分析前体蛋白的相对表达水平。首先在PBST 2% BSA缓冲液中制备含有副蛋白的上清液的系列稀释液。

然后将20 µL稀释液加入到已装有60 µL亚硝酸盐检测试剂溶液的孔板中。立即将孔板转移至酶标仪，使用离心浓缩器或含2% BSA的PBST，在接下来的20分钟内每分钟测量一次485 nm处的吸光度。调整样品的终浓度，使其在约7分钟内水解完全反应体系中的亚硝酸盐，相当于每分钟约2个亚硝酸盐分子的转化速率。

通过用 PBST 洗涤链球菌 TAVR ENC 包被的板，并将板在纸巾上轻拍至干燥，开始 AveXis 检测。接着，向每孔中加入含 BSA 的 PBST，并将板孵育 30 分钟。此步骤可阻断非特异性蛋白结合位点。

在每个孔中，将板子在水槽上方轻轻一甩，去除封闭液，然后向相应的孔中加入100 µL经标准化的生物素化单体诱饵。室温孵育1小时。随后再次轻轻甩去孔中的诱饵样品，并用PBST洗涤3次。

第三次洗涤后轻拍干燥。现在向每孔加入100 µL标准化的五聚体猎物构建物，在室温下孵育1小时。1小时后，用PBST再洗涤平板3次，最后用PBS洗涤1次。

最后，向每个孔中加入 60 µL 七氧化二氮溶液，将酶标板在室温下孵育两小时，或更优方案是在 4 °C 孵育 16 小时。次日，阳性相互作用将变为红色。拍摄酶标板照片以留存视觉记录，然后使用酶标仪在 485 nm 吸光度下定量反应结果。

从AveXis筛选反应开始约10分钟后，抗体介导的猎物捕获对照组以及阳性对照相互作用均出现了由黄色到红色的颜色变化。这种颜色变化表明底物中的亚硝酸盐发生了水解。在此时间尺度上可观察到一些阳性相互作用，但大多数需要数小时才会显现。

通常，阳性命中率约为 0.4% 到 0.6%。一旦制备好蛋白质文库，该技术的筛选部分便可快速完成。在确认相互作用后，一天内筛选多达 12 块培养板是完全可行的。

最重要的下一步是首先证明该相互作用能够使用新制备的独立蛋白重复出现。其次，我们始终要确定该相互作用是否与诱饵-猎物的方向无关，即是否可进行互作验证？这需要将诱饵载体中的结构域克隆到猎物载体中，反之亦然。

可重复且可逆的相互作用被视为高置信度，并始终被证明为阳性。我们倾向于使用表面等离子共振等其他技术，对重新鉴定出的任何相互作用进行额外验证。重要的是，该方法能够证明两种纯化的组分可直接相互作用，也可用于表明结合是饱和的，因而具有特异性。