通过抗体干扰和三维重建研究蛋白质功能及异常蛋白质表达的作用

以下实验的总体目标是以高效且严格控制的方式研究蛋白质功能以及蛋白质表达改变所起的作用。该目标通过使用抗体来减少细胞可利用的功能性蛋白质数量而实现。为达到此目的，将抗体与一种名为 Chariot 的肽偶联，该肽可介导物质穿过细胞膜。

接下来，对目标细胞结构进行成像并构建三维结构，以评估处理的效果。结果表明，Chariot 肽类特别适用于通过抗体干扰来靶向核内蛋白。与 RNA 干扰等现有方法相比，该技术的主要优势在于：导入细胞内的抗体可立即发挥作用，且研究者可通过调整抗体剂量严格控制干扰程度。

尽管该方法可用于研究多种细胞类型中的蛋白质功能，但在靶向原代神经元培养物中的蛋白质时尤为有意义，因为原代神经元对处理非常敏感，却能很好地耐受Chariot转染试剂。准备时，将冻干的Chariot肽粉用无菌水重悬至每微升含2 µg，轻轻敲击管壁，使粉末充分溶解。

然后制备小量的工作液分装，每次反应仅需两微升，并将分装样品储存在20摄氏度。接下来，通过将细胞接种至含有半毫升含抗生素培养基的24孔板中，为转染准备哺乳动物细胞。若使用神经元，仅将细胞接种于中央两行，且接种密度要低。

空的孔板后续有用。动作要快，培养的神经元在孵箱外放置不应超过几分钟。

在神经元达到所需的发育阶段之前，每周两次更换其培养基的四分之一至二分之一。非神经元培养物应在细胞达到50%汇合度时使用。以下步骤适用于六组实验样本和六组对照样本。

针对每种货物，将0.1至2微克的样品用50微升1×PBS稀释。预先结合的一抗和二抗形成的复合物也可作为货物使用。轻轻涡旋混匀溶液，随后进行短暂离心。

然后，每个反应中将 2 µL Chariot 储存液加入 50 µL PBS 中稀释。为防止 Chariot 自行聚集，每个样品需使用单独的离心管。现在，将已准备好的蛋白质加入 Chariot 稀释液中进行混合。

混合并离心合并后的蛋白质。将样品在室温下孵育30分钟，以形成Chariot载体复合物。最佳的蛋白肽用量取决于所用的载体和细胞类型。

因此，该用量应通过实验确定。提前将不含添加剂的培养基以及含有0.5毫摩尔氯化镁和氯化钙的1×PBS预热至37摄氏度。现在，开始将制备好的Chariot复合物用100微升培养基稀释。

移除培养板中细胞的培养基，并转移至空孔中以供重复利用。随后用 500 微升预热的含氯化钙、氯化镁的 1× PBS 缓冲液轻柔洗涤细胞。将含有 Chariot 复合物的培养基加入细胞中，并轻轻摇动培养板，以确保溶液均匀分布。

迅速将细胞放回培养箱，并等待一小时后再进行后续操作。对于神经元，孵育一小时后，将保存的培养基转移至孔板中。对于所有其他细胞，加入血清至终浓度为10%。培养的神经元非常敏感，例如对培养基温度和pH的变化敏感。

因此，应使用预热的溶液轻柔地洗涤和转染这些细胞，并尽快放回培养箱。根据转染的载体和细胞类型，继续培养所需的时间。培养结束后，按常规步骤对细胞进行后续分析处理。

固定方案以及活体成像均适用于该技术。使用配备63倍物镜的激光扫描显微镜时，应以约0.25至0.5微米的间距采集图像，以获得足够细节的Z轴层叠图像，同时避免光漂白。精确的层间距离取决于待重建结构的大小，需根据具体情况单独确定。

进行图像重建时，在 Imaris 中打开 LSM 文件。使用该软件时，按 Escape 键可在“选择”和“导航”模式之间切换。此外，按住 Control 键可同时选择多个对象。

使用显示调整功能，进入每个通道并调节对比度，直至最亮的结构达到饱和。此调整不会影响表面重建，但有助于图像的阈值分割。如果待重建的对象分布在不同的文件中，请使用编辑和添加切片功能，将相应的文件合并。

接下来，点击“添加新表面”图标，然后选择“仅分割感兴趣区域”。现在，调整选择框的边距以贴合目标物体。调整矩形的形状和倾斜角度，直到所有需要的结构均位于框内。

需要在Z平面的每幅图像中调整选区。不需要的物体可在后续步骤中去除。接下来，选择一个合适的通道。

接下来，使用阈值工具重建目标结构。表面区域细节级别（即球体直径）应根据待重建的结构进行设置。根据信号特征，可选择使用绝对强度或局部对比度。

通常，局部对比度对弥散性信号的处理效果更佳。由于该信号的特性，采用局部对比度来重建细胞核内的蛋白质结构。无论何种情况，都需要针对每种目标信号或结构单独调整参数设置。

单击屏幕底部的绿色箭头完成重建。然后使用铅笔工具进一步调整对象。仔细将重建结果与原始信号进行比较，并根据需要倾斜图像以切割和去除表面，确保切割工具能够准确发挥其作用。

现在，通过选择“统计”、“详细统计”和“平均值”来测量每个表面的体积、面积和强度。如果需要，可通过选择相应表面的“颜色”选项卡，并将选定选项从“基础”更改为“统计编码”，从而生成颜色编码的统计结果。使用“拍摄快照”工具，可获取用于发表的图像。

如果需要重建同一区域内的多个对象，可以使用“存储参数”功能来保存相关信息。通过Chariot肽将Simiate抗体导入HEK293细胞后，可特异性检测到Simiate的表达。施用后，Simiate抗体复合物进入细胞体以及细胞核，并与黄色箭头所示的FLAG-Simiate特异性共定位。

Simiate 抗体以剂量依赖性方式在 HEK293 细胞中诱导了大量凋亡，而对照抗体则无此效应。鉴于神经元细胞对毒性作用极为敏感，该技术被应用于原代海马神经元培养物，结果显示，与模拟处理（未处理）组和 Chariot 处理组相比，神经元的存活率未受影响。按照相同的处理方案，可见约 83% 的细胞中存在山羊抗豚鼠 Alexa568 抗体复合物，这些复合物在细胞体和细胞核中均有分布，分布程度各异。

三维分析结果进一步支持了这些观察结果，且与HEK293细胞的实验结果一致。因此，Chariot技术可成功用于转染分离的原代海马神经元。一旦掌握，该技术若操作得当，可在三至六小时内完成。

Chariot 与目标蛋白形成复合物的过程大约需要 40 分钟。将这些复合物转染入细胞需要 70 分钟，另需一至四小时，具体时间取决于货物分子的大小和性质。完成该步骤后，可进一步采用其他方法更详细地分析蛋白功能，例如活细胞成像、运动性分析、分析以及电生理记录。