创建特定的气体环境以研究低氧对 C. elegans 的影响

以下实验的目的是采用连续气流法建立并维持一个低氧环境培养箱。首先需要获取并制备实验所需的管路、烧瓶和培养室。第二步，连接氧气罐并调节流速，以达到所需的低氧水平。

通过将气体通入装有去离子水的鼓泡瓶中，使气体水合。将水合后的气体连接至缺氧室，并将测试样品放入缺氧室中以暴露于缺氧条件下。通过观察个体能否存活至成年阶段，获得结果显示在缺氧条件下存在Hi F1依赖性的胚胎致死现象。

与现有的方法（如手套箱）相比，该技术的主要优势在于其在实验室中易于构建且成本低廉，同时可为环境培养室提供精确且可重复的气体浓度。尽管该方法可用于研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）的缺氧应答，但也可适用于其他系统，包括更大的模式生物和细胞培养。此外，该方法还可用于研究其他气体，如二氧化碳和硫化氢。

本方案演示了如何构建一个缺氧培养箱。气体储存在含有特定氧浓度的压缩气罐中，并连接两级减压阀。气体从流量管底部进入，从顶部以正确的流速流出。

随后气体流入起泡瓶以润湿气体。湿润后的气体经进气阀进入缺氧室，使样品暴露于缺氧环境中。最后，气体通过在室壁上钻出的排气孔排入室内。

可以使用派热克斯（Pyrex）结晶皿或箭头包装盒作为环境培养室的主体。容器的体积应尽可能小，且材料必须对气体不渗透。使用碳或金刚石钻头在容器的一侧钻孔，并安装塑料软管接头。

在将环氧树脂涂敷到盒体和配件之前，先将其混合均匀。然后在容器的另一侧重复相同的步骤，第二个孔的位置应与第一个孔错开。为增强湍流混合效果，使用外径为 1/8 英寸的 FEP 或尼龙管将压缩气体钢瓶连接至流量控制装置，例如质量流量控制器或转子流量计。

气体钢瓶中的氧气浓度应使用氮气进行平衡，且氧气含量需符合已认证的标准，或达到无氧条件。使用纯氮气时，应采用两级减压阀，并将第二级调节至所需压力。有关选择合适流速的说明，请参见书面实验方案中的指导。

然后将双级减压阀的管路连接至控制进入腔室气体流速的流量管。流量管的出口端连接一个内装蒸馏水并带有烧结玻璃筒的气体洗涤瓶。再将洗涤瓶另一侧的管路连接至环境腔体上的一个接头。

这将使进入环境室的气体保持湿润。使用真空脂密封环境室，然后在环境室盖子上放置重物，以确保密封严密不漏气。

通过在戴手套的手掌中取少量水，接触培养室的气体排出口接头，观察是否有气泡产生，以检测密封性。首先，制备同步化的海蜗牛种群。在未接种的线虫生长培养基平板表面，将1至100只GR成虫置于一滴碱性次氯酸钠溶液中。

在孵育至少八小时后，使漂白液充分吸收至平板中。将同步化的L1幼虫转移至接种了活体OP50细菌的平板上。或者，让GRA成虫在平板上产卵两到三小时，以获得一组同步发育的线虫，或从混合群体中挑选L4幼虫以收集年轻的胚胎。

在二至四细胞阶段，用刀片在少量水中切碎GR成虫，然后用口吸管将胚胎转移，再将线虫转移到培养皿中以暴露于低氧条件。在培养皿边缘周围放置一圈浓度为10毫克/毫升的棕榈酸乙醇溶液，以防止线虫逃离琼脂培养基表面。

棕榈酸将从溶液中析出。随着乙醇蒸发形成物理屏障以确保均匀性，在将样品放入环境舱之前，务必更换气体洗涤瓶中的水。将线虫转移至培养板后，将培养板密封于环境舱中，启动气体流，持续暴露至所需时间以进行检测。

为评估胚胎发育至成虫的存活率，将线虫在恢复常氧环境后继续培养48小时，此时线虫应发育至四龄幼虫或一龄成虫阶段，记录其发育至成虫的存活率。为观察线虫在低氧暴露后的表型，将线虫转移至含有M9缓冲液的液滴中，置于22毫米方形盖玻片上，如有需要，将其倒置在含有2%琼脂糖的M9缓冲液垫上。

可使用25毫摩尔的amol或10毫摩尔的叠氮化钠作为麻醉剂。或者，在暴露于低氧环境后，可将透明环境室直接放置在解剖显微镜的载物台上。图中显示了两个视角，其一包含完整的气体流动装置。

另一个仅将小室置于显微镜载物台上。在四个直径为10厘米的高型培养板上培养Bristol N2线虫，直至大部分线虫发育至GR成虫阶段。用1:5的碱性次氯酸钠溶液将线虫冲洗至15毫升圆锥形离心管中，并在旋转孵育器中孵育，直至线虫开始溶解。

不超过五分钟。用M9溶液清洗线虫三次，每次以1,500 × g离心，两次清洗之间无需使用破碎板。将漂白后的胚胎转移至8个150毫米的NGM平板上，让胚胎发育约48小时至L4幼虫阶段。

在22摄氏度条件下，将培养皿放入环境舱中，并置于低氧和无氧环境中处理四小时，或根据实验设计规定的时长进行处理。为快速收获样品，需打开低氧舱的盖子。取出一个样品培养皿后，立即重新密封舱体，并记录操作步骤和时间。

将线虫从缺氧环境中取出后，整个操作过程应少于两分钟。用去离子水将线虫冲洗至尼龙滤膜上，然后倒入已标记的15毫升锥形管中，管内含有100微升1% SDS溶液，随后在台式离心机中以1,500 × g离心15至20秒。

暂停时，使用真空装置从管中移除大部分上清液，保留虫体沉淀不受扰动。用移液器将虫体沉淀连同预定体积的液体转移至已标记的1.5 mL离心管中。若样品将用于SDS-PAGE，则可在该管中加入等体积的2倍蛋白上样缓冲液，密封管子后浸入液氮中。

重复上述步骤，直至所有样品均被分离。为保持一致性，室内空气对照样品也需按照相同流程处理，并可于-20摄氏度保存。该图显示了暴露于1000 ppm氧气、5000 ppm氧气以及常氧环境（约210,000 ppm氧气）下胚胎的存活率。

将胚胎置于持续流动的氧气培养室中，每种条件下暴露24小时。随后将线虫转移至常氧条件下培养48小时，使其发育至成年，记录成年存活率。完成此步骤后，可收集样品用于后续分析，如蛋白质印迹、定量PCR或寿命、子代数量等生理学检测。

观看本视频后，您应该能够清楚地了解如何在自己的实验室中搭建连续流式缺氧培养箱。