观察活体胰腺组织切片中的胰岛功能及胰岛-免疫细胞相互作用
2021年4月12日
本研究介绍了活体胰腺组织切片在胰岛生理学及胰岛-免疫细胞相互作用研究中的应用。
本实验方案将有助于阐明免疫细胞相互作用对胰岛功能的影响。活体胰腺组织切片法可在保留组织原有病理特征及天然微环境的前提下，研究胰岛的生理特性与功能。该方法可为胰腺疾病（如胰腺炎、1型糖尿病和2型糖尿病）的发病机制提供新的认识。
首先，将组织块排列在样品托上，确保其宽度不超过刀片范围，从而使振片机缓慢移动时刀片前进的距离尽可能小。在样品托上涂抹一滴超级胶水，并用胶水瓶的尖端将其铺成一层薄层，然后将组织块翻转贴到胶水上，使靠近组织的一侧朝上。轻轻按压组织块，并静置胶水干燥三分钟。
接下来，用螺丝将切片板固定到振动切片机上，并调整刀片的高度和移动距离，使刀片刚好在组织块上方通过并覆盖其整个长度。用镊子轻轻推动组织块，检查胶水是否已完全干燥，然后向振动切片机的托盘中加入冰冷的细胞外溶液，直至完全浸没刀片。将振动切片机设置为切出厚度为120 µm的切片，启动设备，随后观察组织块上切片的分离情况。
当切片从包埋块上浮起时，用毛笔或镊子将其轻轻托起，并放入含有3毫摩尔D-葡萄糖和胰蛋白酶抑制剂的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中。将装有切片的培养板置于摇床上，在室温下以25 RPM的转速孵育1小时。如果需要更长时间保存切片，则将切片转移至15毫升切片培养基中，并将培养板放入培养箱内。
将制备好的脑片在37摄氏度下孵育，用于当天实验；或将已置于24摄氏度培养过夜的脑片转移至37摄氏度环境中至少孵育1小时后再进行实验。记录开始前至少1小时打开显微镜，并将载物台顶部培养箱平衡至37摄氏度。将含有脑片的玻璃底培养皿固定在载物台上。
通过将10倍物镜设置为明场模式来聚焦显微镜，并在切片中寻找橙棕色的椭圆形结构，以明场模式定位胰岛。按下显微镜触摸屏控制器上的CS按钮，将显微镜切换至共聚焦成像模式。若需利用反射光观察胰岛，请开启638激光探测器和PMT探测器。
将激光功率设置在1%至2%之间，并关闭陷波滤光片。使用405纳米激光和PMT检测器观察核酸染料，使用混合检测器检测CD8抗体，并使用488纳米激光和混合检测器观察胰岛素四聚体。
使用载物台控制器的 X 和 Y 调节旋钮，将视野中感兴趣的胰岛置于中心位置。找到感兴趣的胰岛后，切换至 20X 物镜并放大，使胰岛占据视野的大部分区域。对胰岛采集 z 轴层扫图像，然后选择细胞状态良好且周围任何免疫细胞均清晰对焦的最佳光学切片。
将显微镜设置为XYZT模式，并优化参数，以在数小时内每隔20分钟对选定步骤采集一次z轴层扫图像。使用明场和反射光显微镜观察胰腺组织切片中的胰岛。胰岛中的胰岛素会增加颗粒度，并吸收大量反射光，从而增强胰岛的可见性。
通过染色评估了活体人胰腺组织切片的活性。活细胞显示为绿色，死细胞显示为蓝色。另一个反映活性的良好指标是可观测到的基础活动。
当活体胰腺切片加载了可穿透细胞的钙离子指示剂后，在小鼠和人胰腺切片中均观察到葡萄糖刺激引起的反应。同时对葡萄糖刺激过程中单个细胞的荧光强度进行了定量分析。使用二甲苯腙染色和反射光显微镜观察了完整和病变的胰岛。
由于免疫细胞浸润和细胞死亡，病变的胰岛开始失去颗粒感。可使用CD8抗体和胰岛素四聚体染色来鉴定免疫细胞群体。共染色表明这些细胞是特异性靶向胰岛素抗原的效应T细胞。
在此操作过程中，最关键的是必须始终将切片保存在含有蛋白酶抑制剂的溶液中。按照本方案操作后，可开展多种免疫细胞实验功能分析，从而研究免疫细胞相互作用对胰岛功能的影响。
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概述
本研究介绍了活体胰腺组织切片在胰岛生理学及胰岛-免疫细胞相互作用研究中的应用。该方法能够在保持胰岛天然微环境的同时，对其功能进行检测。
关键研究要素
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 胰岛细胞在葡萄糖代谢中起着关键作用。
- 免疫细胞的相互作用可能影响胰岛功能。
- 理解这些相互作用对于研究胰腺疾病至关重要。
- 活体组织切片能够维持细胞的生理环境。
研究目的
- 研究免疫细胞相互作用对胰岛功能的影响。
- 深入了解I型和II型糖尿病等胰腺疾病。
- 建立一种可保留组织病理学特征及微环境的方法。
使用的方法
- 活体胰腺组织切片的制备。
- 使用振动切片机进行精确切片。
- 应用超级胶水固定组织块。
- 实时观察胰岛细胞与免疫细胞的相互作用。
主要结果
- 活体胰腺组织切片法能有效保持胰岛的生理特性。
- 免疫细胞相互作用被证实显著影响胰岛功能。
- 该方法可用于研究潜在的病理机制。
- 所获得的见解可为胰腺疾病的治疗策略提供依据。
结论
- 活体胰腺组织切片是研究胰岛生理学的有力工具。
- 该方法可增进对胰岛功能中免疫相互作用的理解。
- 未来的研究可在此基础上进一步探索胰腺相关疾病。
常见问题
行业重要性概述
活体胰腺组织切片可实现对保存完好的天然微环境中胰岛细胞与免疫细胞相互作用的直接观察，为糖尿病靶点验证中的机制性风险评估提供了具有生理相关性的研究体系。该方法通过维持组织活性以及1型和2型糖尿病等基础病理状态，支持研发团队在符合疾病特征的背景下评估治疗假设，从而提升预测的可信度。该技术通过提供胰岛功能和免疫细胞动态的定量、实时读数，在发现生物学与转化研究之间架起桥梁，对早期糖尿病药物研发中的立项或终止决策至关重要。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过可视化免疫细胞浸润及其对胰岛颗粒完整性和胰岛素释放的直接影响，能够验证治疗假设。
- 操作价值：保持天然组织结构和细胞间相互作用，减少免疫调节型糖尿病疗法在靶点验证中的机制不确定性。
- 预测价值：通过将免疫细胞活性与胰岛功能衰退相关联，为靶点结合提供与生物标志物一致的读出结果，支持项目组合的优先筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：利用钙离子指示剂和胰岛素四聚体染色生成定量荧光读数，以评估化合物剂量依赖性对胰岛功能的影响。
- 操作价值：标准化组织制备和成像流程，确保在不同实验批次和模型系统间获得可重复的基础测量结果。
- 可扩展性：兼容延时显微镜和z轴层扫采集，能够对免疫细胞动态进行数小时的纵向监测。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：保留人和小鼠胰腺组织中的基础病理特征，可在与疾病相关的系统中研究1型和2型糖尿病的发病机制。
- 转化连续性：通过维持对免疫介导胰岛功能障碍至关重要的细胞间相互作用，将早期发现结果与临床前验证相连接。
- 风险调整的推进：通过CD8和胰岛素四聚体共染色实现效应T细胞与胰岛素抗原相互作用的可视化，支持基于机制的决策判断。
流程与工作流整合
活体胰腺组织切片方法适用于从靶点验证到临床前研究的整个发现过程，提供了一个与疾病相关的系统，该系统可维持组织活力和微环境，用于对胰岛与免疫相互作用的机制研究。
- 发现生物学：通过实时观察免疫细胞对胰岛生理功能的影响，支持假设验证，阐明糖尿病发病机制中涉及的通路。
- 筛选：提供可直接用于检测的组织切片，结合葡萄糖刺激下的钙流和胰岛素四聚体结合的定量输出，便于对化合物进行可靠评估。
- 分析：生成包含空间与时间信息的XYZT延时数据和z轴光学切片，使研究团队能够随时间量化细胞反应及免疫细胞的定位。
- 转化研究：保持与疾病相关的病理特征和天然微环境，支持从发现到免疫调节机制临床前验证的连续性研究。
- 企业级复用：建立一个可重复使用的平台，用于在多种疾病模型和治疗模式下研究胰岛功能，减少重复的模型开发工作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接可视化完整组织中胰岛与免疫系统的相互作用，减少机制上的不确定性，从而在靶点验证方面提供可预测的可信度。
- 操作价值：通过受控的切片、孵育和成像方案，保持组织切片的存活能力与功能，确保实验的标准化与可重复性。
- 战略价值：将免疫细胞活性与胰岛功能衰退相关联，为糖尿病药物开发中的后期生物学风险提供依据，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于候选药物在疾病相关体系中减轻免疫介导的胰岛功能障碍的能力，实现对免疫调节候选药物的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备组织处理、振动切片以及用于活体成像观察免疫细胞动态的共聚焦显微镜技术方面的专业知识。
- 依赖于特定仪器设备，包括振动切片机、配备激光探测器（405 nm、488 nm、638 nm）的共聚焦显微镜，以及用于环境控制的载台式培养箱。
- 需要在不同研究团队之间对脑片制备、缓冲液成分（含D-葡萄糖和胰蛋白酶抑制剂的Krebs-Ringer碳酸氢盐溶液）及培养条件进行标准化，以确保实验可重复性。
- 在将该方法应用于不同模型系统（人 vs. 小鼠）或不同疾病状态（1型糖尿病 vs. 2型糖尿病）时，需考虑适应性调整，以维持组织活性及病理相关性。
- 存在一些实际限制，例如需要使用蛋白酶抑制剂以维持脑片完整性，以及在长时间延时成像过程中保持光学清晰度的技术挑战。
