用于在垂直化学和氧气梯度下研究细胞迁移的聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯微流控装置

本实验的总体目标是建立一种聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯微流控装置，用于研究在不同组合的垂直化学梯度和氧气梯度下哺乳动物细胞的迁移行为。该方法有助于解答哺乳动物细胞迁移研究中的关键问题，包括这些梯度对不同类型细胞或具有其他基因的细胞迁移的影响。该技术的主要优势在于，整个实验装置可在常规培养箱中完成，从而为细胞培养提供最佳条件，且无需繁琐的设置和庞大的仪器设备。

该技术的应用可延伸至癌症细胞转移能力的诊断，因为利用微流控装置可以表征细胞运动性以及多种与生理相关的梯度。该方法可为哺乳动物细胞迁移提供深入见解，还可应用于其他细胞研究，例如针对药物浓度与氧张力组合的体外细胞药物筛选实验。

将两克聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物转移至具有顶层流体通道图案的模具上，形成一层薄薄的PDMS。然后，将模具放入真空干燥装置中，对PDMS脱气60分钟。脱气完成后，将模具置于60摄氏度的烘箱中过夜，使PDMS固化。

确保模具处于水平平面。将模具冷却至室温后，再向模具中倒入13克PDMS预聚物，然后在真空干燥器装置中对PDMS脱气60分钟。将一片厚度为一毫米的聚碳酸酯（PC）薄膜缓慢嵌入新鲜的PDMS层中，作为气体扩散屏障。

排出所有存在的气泡。然后，将模具放入60摄氏度的烘箱中过夜。确保模具处于水平面。

将固化后的PDMS冷却至室温后，用手术刀将其切割成约5.5厘米×5厘米的面积，以完全覆盖所有通道图案。然后，将PDMS芯片从模具上剥离。接着，使用直径为2毫米的活检打孔器在芯片上打出进样口和出样口的孔。

将制备好的上层PDMS-PC层存放于无环境灰尘处，以备后续组装。组装器件时，先将制备好的PDMS-PC上层和带有旋涂PDMS膜的晶圆放入氧气等离子体表面处理仪中，使待键合表面朝上。用90瓦的氧气等离子体处理PDMS表面40秒。

在对PDMS膜进行氧气等离子体表面处理后，立即将顶层与之键合。在键合后的各层上方放置一个重物，并将其置于60摄氏度的烘箱中过夜，以促进键合。待键合后的各层冷却至室温后，用手术刀将与顶层键合的膜切割成约5.5厘米×5厘米的面积。

从硅片上剥离键合结构，并使用直径为2毫米的活检打孔器在化学梯度通道的入口和出口处打孔。然后，将带有膜的上层和制备好的PDMS底层放入氧气等离子体表面处理仪中，使键合面朝上。为活化PDMS表面，以90瓦功率进行40秒的等离子体处理。

表面处理后立即对顶层和底层进行贴合并键合。将重物置于整个键合装置的上方，并在60摄氏度的烘箱中放置过夜。第二天，将制备好的整个装置从烘箱中取出，并冷却至室温。

按照文本方案中的描述，在装置中准备细胞，开始微流控细胞迁移实验。第二天，吸去自第零天起培养的细胞的培养基，并用五毫升 DPBS 洗涤细胞两次。吸去 DPBS，加入两毫升胰蛋白酶-EDTA，然后将细胞在培养箱中孵育五分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。

待细胞从培养瓶中脱离并悬浮于溶液中后，向培养瓶中加入 8 mL 无血清培养基。将所有液体转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在室温下以 140 ×g 离心 5 分钟。离心结束后，吸除上清液，并加入适量无血清培养基，调整细胞终浓度为每毫升含 100 万细胞。

然后，按照文本方案所述，取出第一天制备的微流控装置。使用带有钝头14号针头的1毫升注射器，通过化学梯度通道的出口注入无血清培养基，直至培养基从入口两端的针头均流出。接着，从化学梯度通道的出口注入200微升细胞悬液。

在显微镜下观察装置中的细胞培养腔，以确认细胞已引入微流控通道。随后，将装置置于湿润容器中，并在细胞培养孵育箱中孵育5小时，以促进细胞在装置表面的贴附。同时，用无血清培养基配制所需浓度的化学物质。

用两个独立的三毫升注射器分别吸取含化学物质和不含化学物质的无血清培养基，并连接至高纯度导管。随后，将注射器安装在注射泵上，设置流速为每分钟一微升，以备后续使用。接下来，配制15毫升一摩尔的氢氧化钠溶液和15毫升每毫升200毫克的连苯三酚溶液。

将氢氧化钠溶液吸入一支与高纯度PFTE管路相连的15毫升注射器中，将焦性没食子酸溶液吸入另一支与高纯度管路相连的15毫升注射器中。将注射器安装在注射泵上，设定流速为5 µL/min，备用。孵育5小时后，取出整个装置，置于直径15 cm的培养皿中。

使用黏性橡皮泥将装置固定在培养皿中，然后将培养皿转移至培养箱内的活细胞成像显微镜上。将注射器的管路连接到化学梯度通道的入口，以生成化学梯度。随后，将出口连接至通向废液储液池的管路。

打开用于产生化学梯度的注射泵，并连接装有氯化钠和连苯三酚的注射器。接下来，将高纯度管路从装有氯化钠和连苯三酚的注射器连接到氧气梯度通道的入口。将管路连接至出口以收集废液，然后打开用于产生氧气梯度的注射泵。

向培养皿中加入约 15 毫升双蒸水，以保持装置湿润。然后，设置活细胞成像显微镜进行时间推移图像采集，每 15 分钟拍摄一次图像。数据采集与分析以及梯度表征操作请参照文本方案中的描述进行。

图中展示了在微流控装置中生成用于细胞迁移的化学梯度的代表性结果。数值模拟结果与使用荧光素溶液作为化学物质的实验表征结果高度一致。其他化学物质（如趋化因子SDF-1α）的梯度也可通过模拟预先估算。

可通过氧敏感型荧光染料对装置内产生的氧浓度梯度进行实验表征。通常情况下，装置内可稳定建立从上游1%至下游16%的氧浓度梯度。图中显示的是使用活细胞成像显微镜在实验过程中采集的典型时间推移图像。

图像分析后，可计算 A549 细胞的迁移轨迹及其平均移动距离。在无梯度条件下，细胞呈现随机迁移，平均移动接近于零。仅存在 SDF-1 alpha 趋化因子梯度时，细胞表现出趋化行为，并如预期般向趋化因子高浓度方向迁移。

仅存在氧气梯度时，细胞会向低氧方向移动，表现出趋氧性行为，但这种行为在哺乳动物细胞中尚未得到充分研究。有趣的是，在同时存在趋化因子和氧气梯度的情况下，细胞仍趋向低氧梯度方向移动，表明氧气梯度具有主导作用。这一现象有待进一步研究。

在进行该实验操作时，重要的是在器件制备过程中注意调平设备，并在细胞迁移实验中微流控装置组装时彻底排除气泡。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备PDMS-PC微流控装置，并设置实验以研究哺乳动物细胞在化学梯度与氧气梯度联合作用下的迁移行为。