GST-His纯化：一种两步亲和纯化方案，可获得全长纯化蛋白

以下实验的总体目标是获得一种高度纯化的全长目标蛋白。通过构建重组杆状病毒，感染SF nine昆虫细胞，从而高效表达并获得可溶性的双标签目标蛋白。随后进行两步亲和纯化，首先纯化谷胱甘肽S-转移酶标签蛋白，继而进行金属亲和层析。

纯化结果为获得高纯度的组氨酸标签蛋白。接下来，对纯化的蛋白样品进行透析，以确保储存缓冲液中的盐浓度较低。通过SDS-PAGE凝胶的总蛋白染色，可获得反映蛋白表达的可溶性、产量和质量的结果。

我们最初想到这一方法是由于在纯化 PAL B2 和 BOC2 等大分子且不稳定的蛋白质时遇到了困难。因此，与一步亲和纯化等现有方法相比，该技术的主要优势在于：在我们的两步亲和纯化方案中，所获得的蛋白质纯度很高，通常不含降解产物。该方法有助于回答蛋白质生物学领域中的关键问题，例如纯化后的重组蛋白质的生化功能。

本方案首先进行重组杆状病毒的制备，随后根据文本方案中所述方法筛选感染效率最高的BA病毒。准备一个旋转培养瓶，其中含有500毫升培养基，内含0.75至1.0 × 10⁶个SF9细胞，病毒与培养基的比例为1:150。将旋转培养瓶置于细胞培养罩内，通过旋转瓶的一侧管口将适量的杆状病毒悬液加入细胞悬液中以感染细胞。

将感染的细胞在27摄氏度下悬浮培养，当蛋白表达量达到最高时收获细胞，该时间点由选择最有效的杆状病毒决定。收获细胞后，在冰水浴中用约20毫升GST结合缓冲液裂解表达目标蛋白的SF9细胞，并加入蛋白酶抑制剂。使用Dounce匀浆器上下吹打20次，随后进行三次32秒的超声处理，之后再次吹打20次。接下来，在4摄氏度下以18,000 RPM离心细胞裂解液30分钟，保留上清液。将可溶性细胞裂解液与1毫升预先洗涤过的GST磁珠在4摄氏度下轻柔旋转孵育1小时。

应根据前体的稳定性及结合后的结合效率优化孵育时间。在700 RPM条件下短暂离心，去除含有未结合蛋白的上清液。用GST洗涤缓冲液洗涤与GST结合的蛋白。

在最后一次洗涤后重复此步骤两次。尽可能吸除上清液。然后将珠子与5毫摩尔ATP和15毫摩尔氯化镁在10毫升GST结合缓冲液中，于4摄氏度孵育一小时，以避免热休克蛋白在孵育后发生非特异性结合。

用 GST 洗涤缓冲液洗涤珠子三次。离心 GST 珠子并去除上清液后，用 P five 缓冲液洗涤 GST 珠子。接下来，将 GST 珠子分装成每份 100 微升的等份，加入 4 至 8 个单位的 Precision 酶，该酶用 100 微升 P five 缓冲液稀释。

将GST磁珠与酶在4°C、温和旋转条件下孵育3小时至过夜。孵育时间应根据蛋白的分子量及其在切割后的稳定性进行优化。短暂离心并收集上清液。

向珠子中加入100微升P5缓冲液。然后重复离心和上清收集步骤两次。收集所有组分。

将EIT分成三份，每份一毫升，每份与100微升预洗涤的Talon金属亲和树脂干珠在旋转条件下孵育一小时，将洗脱分成多个组分，以提高结合和洗涤效率。然后在4摄氏度下，用P 30缓冲液轻轻旋转洗涤树脂五分钟。重复洗涤两次后，将珠子收集至同一管中，以洗脱纯化的蛋白。

向结合有蛋白的Talon树脂中加入P 500缓冲液。加入与树脂等体积的缓冲液。在旋转条件下孵育悬浮液5分钟。

重复此步骤两次，将每次洗脱的组分分别收集，用于储存纯化后的蛋白质。在4°C条件下，于适当储存缓冲液中振荡透析两次，每次一小时。

透析过程中需注意检查纯化后的蛋白质是否发生沉淀。将纯化后的蛋白质分成小份，置于干冰上冷冻30分钟，然后于负80摄氏度保存，避免反复冻融。

通过将每种组分约 20 至 40 微升上样到 SDS-PAGE 凝胶上来分析纯化过程。凝胶电泳后，使用考马斯亮蓝或蛋白质染色剂染色以进行可视化。对感染 REC14 重组杆状病毒或作为对照的未感染（模拟感染）SF9 细胞的可溶性及总细胞裂解液进行考马斯亮蓝染色分析，从而确认 GST-RE14-His 蛋白在纯化过程中的表达。通过考马斯亮蓝染色分析多个样品，以追踪该方法的纯化效率。

染色结果显示，在纯化的第一步中，GST-Rec14 正确结合到 GST 琼脂糖珠上，由于 Rec14 与 GST 融合，其表观分子量约为 50 千道尔顿；经 GST-GST 蛋白酶精确切割后，游离的 Rec14-His 在约 37 千道尔顿处迁移。尽管部分游离的 GST 仍保留在 GST 琼脂糖珠上，且有一定量的 Rec14-His 仍结合在 GST 琼脂糖珠上，但已实现 Rec14-His 的显著富集。通过延长蛋白质与 GST 蛋白酶的孵育时间，该步骤可进一步优化。将结合在 Talon 琼脂糖珠上的 Rec14-His 与 GST 纯化步骤后提及的蛋白质进行分析比较，结果显示大部分 Rec14-His 能结合到 Talon 琼脂糖珠上。

经过多次洗涤后，收集到 REC 14 hiss，并进行了三次假象实验。分析结果显示，REC 14 hiss 纯度较高，并且在洗脱组分与 talon beads 的首次洗脱比较中，REC 14 hiss 浓度最高，这表明假象实验具有较高的效率。由于仅有少量 REC 14 hiss 可被检测到与 beads 结合。

这些样品还使用抗 GST 和抗 hiss 抗体进行了 Western 血液分析，以追踪 REC 14。在整个实验过程中，抗 GST 印迹结果显示，在 GST 纯化步骤获得的上述蛋白中存在部分 GS TRE 14 和单独的 GST，而 hiss 标签亲和纯化步骤去除了这些污染物。该印迹结果表明，通过精确处理和 hiss 标签纯化步骤，GST 已从 re 14 中被高效去除。

抗His印迹旨在检测Rec 14。该印迹证实GST-Rec 14-His和Rec 14-His未被完全切割并从GST磁珠中去除。此外，在高浓度下，Rec 14似乎发生聚集。

综上所述，实验结果表明，GST hiss 纯化法在纯化 S palm B rec 14 蛋白方面具有高效性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何回收一种高度纯化的重组蛋白，一旦熟练掌握该技术。

如果操作得当，该技术可在可溶性裂解液降解后的12小时内完成。在进行此实验时，必须注意快速操作并严格在4°C条件下进行，以避免蛋白质降解。在此步骤之后，还可采用其他方法，如共沉淀实验或质谱分析，以回答更多问题，例如鉴定目标蛋白的相互作用蛋白或目标蛋白的翻译后修饰情况。

尽管我们使用该方法研究DNA，但修复蛋白的研究策略可加以修改，以用于研究蛋白质在其他研究领域的功能。