实验性人类肺炎链球菌定植

本实验的目的是建立实验性人肺炎球菌定植模型。首先，对接种物中的细菌进行稀释和定量。第二步，通过鼻腔将肺炎链球菌接种至志愿者体内。

接下来，在接种后的第2天、第7天和第14天，志愿者需进行鼻腔冲洗。最后，采用经典微生物学方法检测志愿者是否携带接种的肺炎球菌。最终，可通过这种安全且可重复的方法建立实验性人肺炎球菌定植模型。

与现有的小鼠定植模型相比，该技术的主要优势在于其提供了肺炎链球菌在自然宿主——人类中的定植模型。此外，该方法有助于解答肺炎链球菌研究领域中的关键问题，例如：保护性免疫的免疫学相关因素是什么？定植的免疫诱导效应是什么？宿主压力对鼻咽生态位中病原体的影响又是什么？

该技术的应用包括将其作为一种筛选新型肺炎球菌疫苗的方法。我们计划将定植的预防作为疫苗诱导免疫的替代指标。临床技术的演示将由护士安吉·赖特（Angie Wright）和护士长戴维·肖（David Shaw）进行。

在预定的志愿者接种时间前30分钟，从-80摄氏度冰箱中取出一管接种物原液。然后将接种物在微型离心机中以17,000 × g离心3分钟。在离心过程中，将一些血琼脂平板放入37摄氏度培养箱中预热。

然后从离心后的接种液中去除肉汤上清，将菌体沉淀用一毫升生理盐水洗涤。重复离心和洗涤步骤。根据所需接种浓度进行系列稀释，随后采用类似 Miles 和 Misra 的方法对接种液中的细菌数量进行定量。

培养的菌落将于次日可见。将接种物带给志愿者，志愿者应舒适地采取半卧位。然后使用 P 200 移液器和无菌滤芯吸头。

用移液枪吸取100 µL接种物至移液枪头中，将枪头轻轻插入鼻腔内侧。使用环形动作缓慢将接种物释放到鼻黏膜上。切勿将移液枪头插入过深，否则接种物会流入喉咙。

对另一侧鼻孔重复接种操作，以避免细菌进入血液。注意不要用移液器损伤黏膜。然后让志愿者保持半卧位 10 分钟，以使细菌在黏膜表面充分扩散。

向志愿者接种接种物后，在实验室重复进行细菌定量。然后用接种日期和剂量标记试管，并将接种物在负80摄氏度下保存。开始鼻腔冲洗前，让志愿者舒适地坐着，头部从垂直位置向后倾斜30度。

然后让受试者深吸一口气并屏住呼吸，同时将舌头向上并向后紧贴上颚。当受试者达到该位置时，应给出信号示意。随后用20毫升生理盐水冲洗鼻腔四次，每次向鼻前庭注入5毫升生理盐水并排出。

每次用5毫升生理盐水冲洗后，让志愿者立即向前倾身，通过鼻子快速呼气至铝箔碗中，以排出液体。在用四次20毫升生理盐水清洗鼻腔后，将所有收集的样本合并至一个离心管中。现在以3,345 × g离心志愿者鼻洗液样本10分钟。去除上清液，并将其分装为每管1毫升，置于已标记的微量离心管中，于-80摄氏度保存。

向沉淀中加入100 µL STGG培养基并充分混匀，然后测定试管中的总体积。接下来，取20 µL重悬后的沉淀液滴加到含庆大霉素的血琼脂平板上，并划线接种至整个平板。如果鼻洗液为接种后样本，则使用含重悬沉淀的STGG溶液10 µL。

采用 Miles 和 Misra 法进行细菌定量时，向鼻洗液管中再加入 800 微升 STGG 并充分混匀。然后取 25 微升 STGG 细菌悬液接种至另一块血琼脂平板，另取 25 微升接种至巧克力琼脂平板，将两块平板表面完全划线接种。随后将剩余细菌分装于两个冻存管中，于 -80 摄氏度冷冻保存。

将平板置于5%二氧化碳环境中，37摄氏度孵育过夜。次日，检查平板上是否存在肺炎链球菌及其他潜在呼吸道病原体。接种了鼻洗液的血琼脂平板可能较难判读。

此图像显示了一个易于观察的平板示例，其中肺炎链球菌清晰可见。然而，该平板含有大量共定植的菌群，使得在每次随访时判断是否存在肺炎链球菌更加困难。研究人员要求志愿者报告是否存在任何上呼吸道症状，并对携带者与非携带者之间的差异进行了重点比较。

在最近接种了肺炎球菌的145人中，有28人报告出现症状，这些症状总结于本表中。这些志愿者中有8人为携带者，20人为非携带者。所有不良反应均经外部安全委员会审查，并在全面调查后进行了评估。

未出现与肺炎链球菌疾病相关的症状。最常见的症状为咽喉痛、鼻塞和流感样疾病。在实施该操作时，必须制定非常周密的安全计划，涵盖方法的每一步骤，尤其要保障志愿者的安全。

观看本视频后，您应充分了解如何建立实验性人肺炎链球菌定植，并通过鼻腔冲洗液检测定植情况。