一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

本实验方案的总体目标是展示一种微流控芯片的制备与操作方法，该芯片可实现高效的单细胞分离与培养。该方法为任何需要单细胞分离与培养的领域提供了有用的工具。该技术的主要优势在于，能够高效地将单个细胞加载至大型微孔阵列中。

此外，该装置仅利用轻微的流体流动和重力作用进行操作，从而最大限度地减少细胞损伤。该技术的应用方向是人类疾病的终末期诊断，例如癌症，其中细胞异质性会影响细胞的反应。我们在建立微孔细胞系时提出了开发此方法的想法，因为有限稀释法非常耗时且效率低下。目前该方法可为单个细胞分析提供新的研究视角。

它还可应用于其他方面，例如单个细胞过程和行为的观察建立及其时间性分析。首先，采用标准光刻技术，按照随附文本方案中的描述，分别制备用于单细胞分离层和微孔培养层的硅烷化主模具。对于每个主模具，将16克PDMS基液与1.6克固化剂加入一次性杯子中混合，并搅拌至均匀。

然后，将主模具放入150毫米的培养皿中，并将PDMS倒在模具表面。将培养皿放入真空干燥器中，抽真空一小时以去除PDMS中的气泡。一小时后，从干燥器中取出培养皿，置于65摄氏度的常规烘箱中加热三至六小时，使PDMS固化。

然后，将培养皿从烘箱中取出，使其冷却至室温。冷却后，从主模具上剥离固化好的PDMS捕获孔阵列和微孔培养阵列，并使用刀片切割出所需器件。接着，使用0.75毫米打孔器在捕获孔阵列层的微通道两端各打一个孔。

使用胶带清洁即将成为装置内表面的区域，然后将各层内表面朝上放入等离子清洗仪中，进行短暂的氧气等离子体处理。处理完成后，将PDMS层从等离子清洗仪中取出，并使用体视显微镜对准并连接装置的顶层与底层。将对齐后的装置置于65摄氏度的烘箱中24小时，使PDMS层之间形成永久性键合。

接下来，将键合好的PDMS装置置于去离子水中，并将容器放入真空干燥器中抽真空15分钟，以去除装置微通道中的空气。待装置内所有空气完全排出后，将PDMS装置移至组织培养超净台中，用紫外光照射30分钟，对装置表面进行灭菌。随后，将装置中的去离子水更换为含5%牛血清白蛋白的PBS溶液，并在37°C条件下孵育30分钟。

这将封闭表面，并提高捕获孔中分离细胞向培养孔的转移效率。30分钟后，用无菌PBS替换装置中的封闭液。制备浓度为每毫升250万个细胞的单细胞悬液，并用50微升该悬液上样至移液器中。

然后，通过装置的出口孔将细胞转移至装置内。再加载50微升细胞悬液，并通过入口孔将其注入装置，使细胞均匀充满整个微通道。加载完成后，使用由直径1毫米的尼龙钓鱼线制成的无菌塞子封闭装置的出口孔。

然后，用1毫升无菌注射器吸取培养基，排出所有残留的气泡，并将注射器放入注射泵中。将一根23号钝头针连接到注射器上，并使用聚四氟乙烯管将针头与装置的入口连接。连接管路后，移除出口孔的塞子，静置两分钟，使细胞在重力作用下沉降至单细胞捕获孔中。

接下来，将注射泵设置为 600 微升每分钟。移除出口塞，冲洗未捕获的细胞 30 秒。等待两分钟，使压力稳定。

然后将离心管从装置的入口处取下，并用堵头密封入口和出口孔，形成一个封闭的培养系统。接着用手翻转装置，使捕获的单细胞转移至装置另一侧的培养微孔中。随后，将装置放入100毫米的组织培养皿中，在装置周围加入10毫升灭菌的PBS，并将培养皿放入培养箱中。

更换培养基时，首先在靠近微通道入口和出口的 PDMS 装置顶部放置两滴培养基，以避免将气泡引入微通道。然后，使用 0.75 毫米的活检打孔器从微通道两端附近的 PDMS 装置顶部打两个孔。注意仅穿透装置的顶层即可。

接下来，用1毫升塑料注射器吸取新鲜的预热培养基，并使用23号钝头针和聚四氟乙烯（PTFE）管将其连接到新创建的进样口。在5分钟内缓慢注入约120微升新鲜培养基，以替换原有培养基。操作完成后，使用两个堵头密封进样口和出样口，并将装置放回细胞培养孵育箱中。

最终进入捕获孔的细胞数量占总数的68%至85%，具体比例取决于细胞类型。此外，三种细胞类型的大多数捕获孔中仅含有单个细胞。在将捕获的KT98细胞转移至培养孔后，约77%的孔中只有单个细胞，16%的孔中无细胞，6%的孔中有两个细胞，少于1%的孔中含有三个或更多细胞。

在七天的过程中，分离的单个细胞表现出异质性的生长模式。部分细胞发生增殖，而另一些细胞则未增殖。一旦掌握该技术，若操作得当，可在约20分钟内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用这种高通量单细胞分离内分泌培养平台，以提高单细胞实验的工作效率。在操作该流程时，需特别注意避免气泡进入微通道，并防止细胞随时间推移发生聚集。