酿酒酵母SNX-BAR异源二聚体的表达、纯化及脂质体结合

SNX-BARs 是一类膜重塑蛋白，在人类疾病中发挥关键作用。利用我们的方法，可以确定其精确的生物物理特性，以促进脂质结合和膜重塑。从酵母细胞中纯化 SNX-BAR 蛋白，能够获得天然的同源和异源 SNX-BAR 二聚体，同时最大限度地减少非天然表达系统中常见的毒性及不溶性问题。

我们的方法可用于研究所有酵母 SNX-BAR 蛋白的脂质特异性，或用于从其他任何生物体中表达重组 SNX-BAR 蛋白。正确的挤出器组装对于防止挤出过程中脂质体损失至关重要。对于初学者或刚进入该领域的研究人员而言，直观地观察最关键的步骤将显著提高实验成功的可能性。

首先，将大量酵母细胞接种至一个体积至少为培养液体积四倍的锥形瓶中，培养液为50毫升含2%棉子糖和0.1%葡萄糖作为碳源的标准YP培养基，在30°C摇床中过夜培养。次日早晨，将50毫升预培养物接种至2.8升带挡板的Fernbach锥形瓶中，其中含1升添加2%棉子糖和0.1%葡萄糖的标准YP培养基，在摇床培养箱中培养4至5小时。当600纳米处的光密度达到0.2时，向培养物中加入半乳糖，使其终浓度为2%，继续在摇床培养箱中过夜培养。

第二天早晨，通过离心收集细胞，并将酵母沉淀转移至一个50毫升的锥形管中。用15毫升纯化缓冲液重悬沉淀，使最终体积约为30毫升，然后将细胞悬液加入预冷至4°C的均质器中。在20,000至25,000 psi压力下裂解样品，进行两到三轮，随后将裂解液转移至冰上预冷的新50毫升锥形管中。

立即通过离心澄清细胞裂解液，并小心将上清液转移至新离心管中。接下来，用纯化缓冲液将300 µL IgG Sepharose微珠重悬并洗涤三次，以平衡微珠，然后将其加入已澄清的细胞裂解液中，在4°C下旋转孵育两小时。孵育结束后，将微珠加入10 mL层析柱中，使未结合的裂解液流穿。

每次使用一毫升洗涤缓冲液洗涤珠子，共洗涤10次，每次均需待液体完全流尽后再加入下一次的洗涤液体。最后一次洗涤后，使用移液器和新鲜缓冲液将珠子转移至一个微量离心管中。用新鲜洗涤缓冲液将珠子总体积调至500微升，并加入2微升浓度为10毫克/毫升的TEV蛋白酶，于4摄氏度旋转孵育过夜。

第二天早晨，使用27号针头彻底去除上清液，并通过10%聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳检测蛋白质纯度。然后根据标准方案，使用Bradford蛋白定量法对浓缩后的蛋白质进行定量，并将蛋白质在4°C条件下保存，最多可保存一周。制备脂质体时，使用玻璃注射器将储备脂质转移至洁净的玻璃培养管中，配制成终浓度为1%磷脂酰肌醇-3-磷酸、20%麦角固醇、30%磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱的脂质混合物，具体比例见表格所示。

根据每种脂质所溶解的溶剂不同，添加每种脂质时混合物可能会变得浑浊。将低流量氮气以环形方式均匀吹向玻璃试管底部的脂质混合物，小心地将脂质混合物吹干。然后用铝箔包裹玻璃培养管，管口保持敞开，再将脂质在真空条件下进一步脱水一小时。

孵育结束后，向每个小瓶中加入 400 微升结合缓冲液，以完全重新水化脂质，使脂质体终浓度为 2.5 毫摩尔，然后在室温下以中等速度涡旋振荡 30 分钟以重悬脂质。随着脂质的重悬，缓冲液应变得浑浊。将重悬后的脂质体转移至微量离心管中，先在液氮中速冻，随后在 37 摄氏度水浴中解冻，重复此冻融过程七到八次。

在化学通风橱中，用一毫升氯仿对两个一毫升玻璃注射器各冲洗三次，每次充满全部体积，以去除任何残留脂质，并用两倍体积的超纯水和两倍体积的结合缓冲液对每个注射器进行平衡。根据制造商的建议组装微型挤出器。然后将两片滤膜支撑片浸入含有200纳米膜的结合缓冲液中。

组装微型挤出器时，必须确保其完全密封。检查是否漏液的一个有效方法是让缓冲液流经装置。将膜夹在滤膜支撑板之间，并将膜放入微型挤出器中。

使用一个已平衡的1毫升注射器，将与脂质体混合物体积相近的结合缓冲液推过微型挤出器，并用另一支注射器吸取脂质体混合物，将微量离心管倒置，使残留的脂质体汇集至管盖，以便收集。随后将脂质体通过200纳米膜挤出19至21次，并将挤出后的脂质体收集至新的微量离心管中。在进行SNX-BAR脂质体结合与成管实验前，需通过超速离心对纯化的蛋白进行预清除处理，并将上清液转移至新的微量离心管中，注意勿扰动沉淀。

接下来，在30微升的总反应体系中，将4微摩尔的纯化SNX4-ATG20与2.5毫摩尔的脂质体在30摄氏度下孵育30分钟。为观察和定量脂质体的管状结构形成，在孵育结束后立即将样品滴加到碳支持的铜网载网上，并用1%醋酸铀进行负染。随后在200千伏的透射电子显微镜下分析样品。

进行脂质体结合与沉淀时，将20微升反应液转移至聚碳酸酯离心管中，并使用匹配的转子在超速离心机中离心样品。离心结束后，小心地将上清液转移至新的微量离心管中，并将沉淀重悬于40微升SDS-PAGE上样缓冲液中。将沉淀悬液转移至新的微量离心管中，并向上清液中加入20微升上样缓冲液。

然后将沉淀和上清液等体积的样品加入10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶中，并进行考马斯亮蓝染色，以观察SNX-BAR蛋白与脂质体的结合情况。为验证SNX-BAR表达是否正确诱导，可使用针对串联亲和纯化标签的蛋白质印迹（Western blot）进行检测，因为SNX-BAR蛋白的表达水平可能无法通过考马斯亮蓝染色检测到。在完成SNX-BAR异源二聚体的纯化后，两种SNX-BAR蛋白的条带应呈现1:1的化学计量比，且几乎无或仅有极少的杂蛋白条带。

在此代表性分析中，SNX-BAR 异源二聚体被表达、纯化，并如所示与合成脂质体结合。请注意，MVP1 形成同源二聚体，并如预期在细菌中表达。可通过密度测定法对 SNX-BAR 与不同组成脂质体的结合进行定量，以评估磷脂酰丝氨酸等成分对脂质体结合的影响。

电子显微镜成像可用于测量 SNX4-ATG20 脂质体管状结构，大多数管状结构的直径通常在 14 至 26 纳米之间。需要注意的是，可将纯化的 SNX-BAR 蛋白与脂质体上的货物捕获复合物重组，以研究完整组装体如何影响膜重塑过程。在比较不同纯化的 SNX-BAR 二聚体组合与由不同脂质组成的合成脂质体结合能力时，发现 SNX-BAR 蛋白具有特异的脂质结合偏好性。

处理氯仿时务必在通风橱中操作，处理锐器或玻璃制品时应穿戴适当的个人防护装备。