利用实验设计方法表征复杂系统：以烟草中瞬时蛋白表达为例

以下实验的总体目标是建立植物叶片中蛋白质瞬时表达的预测模型。通过设计实验，确定影响瞬时表达的最关键参数，并量化其对蛋白质积累的影响。第二步是将基因克隆并转入农杆菌中，随后将农杆菌注入叶片，从而实现蛋白质的瞬时表达。

接下来分析叶片样品，以确定蛋白质表达水平。通过实验设计模型评估，获得不同叶龄叶片在不同孵育条件下瞬时蛋白质表达水平的变化模式。与传统的单因素试验等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够检测并量化不同参数（如叶片年龄或着生位置）之间的相互作用。

通常用于表征某些因素对实验结果影响的“一次只改变一个因素”方法并不理想，因为实验过程中的各个运行如同串在一条线上的珍珠，导致实验设计空间的覆盖范围较低。相比之下，实验设计（DOE）策略中同时改变多个因素，能够增强对设计空间的覆盖，从而提高所建立模型的精确性。此外，“一次只改变一个因素”的方法会导致设计空间覆盖存在偏差。

实验可能无法识别出最佳操作区域并预测出次优解，而实验设计（DOE）策略则更有可能确定出更优的条件。此流程图说明了规划 DOE 策略的过程。第一步是确定设计中需包含的相关因素和响应指标。

在此演示中，将基于先前的实验测定一种模型抗 HIV 单克隆抗体 two G 12 和一种荧光标记蛋白 DS red 的表达水平。被视为具有显著意义的最小可检测差异，two G 12 为 10 微克/毫升，DS red 为 20 微克/毫升。此外，two G 12 和 DS red 系统估计标准差的近似值分别为 4 微克/毫升和 8 微克/毫升。

本实验设计（DOE）策略的其余规划步骤此处不再讨论，详细信息可参见随附的手稿。两种G 12和DS红色蛋白将在烟草植物中进行瞬时表达。开始植物培养实验前，准备10厘米×10厘米×8厘米的岩棉块，并用去离子水充分冲洗，以去除残留化学物质。

随后，将新配制的肥料溶液加入各岩棉块中进行平衡处理，在每块岩棉上放置一至两粒烟草种子，再用肥料溶液短暂冲洗。注意避免将种子冲走，在温室中适宜条件下培养烟草植株，使其萌发并生长42天。通过将培养物生长至600纳米处的OD值为5.0来制备AUM FASS。

用清水和两倍的侵染培养基稀释菌液，使其在注射前达到所需注射浓度的OD 600纳米值。注射前确认Atum Fasion悬浮液的OD 600纳米值，以准备进行叶片注射。用移液器吸头轻轻刮擦注射位点的表皮，以促进AUM Fasion溶液的渗入。

操作时避免刺破叶片。将装有AUM悬浮液的注射器垂直于叶片，筒身轻触待处理的叶脉间区域，轻轻将出口端推至叶片底面。同时，轻压叶片上表面，防止叶片移位或破裂。

轻轻下压注射器活塞，AUM 配方溶液将进入叶片的细胞间隙，处理区域会呈现较深的绿色并显得湿润。注射过程中应确保注射器始终保持与叶片垂直。

否则，细菌悬液可能在高压下喷出。在多个位置重复此操作，直至整个叶间区域均被aum、aum、fass浸润。注射完成后，继续处理下一个叶间区域，并将植株置于美国能源部（DOE）规定的条件下培养，待培养期结束后继续后续操作。

开始取样。用手持纸巾固定叶片，并使用打孔器从处理过的叶脉间区域按能源部（DOE）指定的位置和时间取出四到五个叶圆片。取样过程中不得将整片叶子从植株上取下。

确定每个样品的质量，并将其放入已标记样品名称和质量的1.5毫升塑料离心管中。在进行蛋白质定量前，将样品储存在负20摄氏度或负80摄氏度条件下。根据样品稳定性和储存温度，此步骤可暂停数月，以便从叶盘样品中提取蛋白质。

每毫克样品质量加入3毫升提取缓冲液，使用电动研磨杵在反应管中研磨叶圆片，直至无较大碎片残留。为避免样品过热，每次离心后若管壁感觉温热，应将反应管置于冰上冷却。为去除分散的固体成分，将上清液转移至一支洁净的1.5毫升反应管中。

依次连续两次测量DS红荧光。使用配备530 ± 25纳米激发滤光片和590 ± 35纳米发射滤光片的96孔板读板仪对每个样品进行检测。对两次读数及三个技术重复的荧光值取平均，并减去含0微克/毫升DS红的空白对照所记录的数值。

同时将该值从标准稀释液的读数中减去，并使用这些空白校正值进行线性回归，得到一条参考曲线。然后利用参考曲线的斜率将样品测得的荧光值转换为DS红的浓度。此处不展示两种G 12抗体浓度的测定步骤，相关内容详见随附的手稿。

在分析节点中，使用 Design Expert 软件进行数据分析与评估。选择待分析的响应值，并在转换选项卡中初始选择“无”。然后进入拟合汇总选项卡，该选项卡提供有关所研究系统中重要因素的一般信息。

软件将根据模型选项卡中的显著性建议一个初始模型。该初始模型是基于拟合摘要结果预先选定的。请使用自动化模式在 Innova 选项卡中编辑此模型。

如有必要，检查所建议的模型及包含的因素。通过切换回模型标签页，将选择方式更改为手动，然后从模型中移除 P 值高于预设阈值或根据机制分析认为不太可能的因素。继续进入诊断标签页，以确认模型的质量，并检测数据集中可能对模型产生强烈影响的潜在异常值。

通过检查诊断工具中的所有选项卡，根据箱型Cox图的建议，在相应选项卡中调整变换类型，并在模型图形选项卡中重新启动分析流程。针对少量数值型因子（例如三个）可视化评估后的模型。响应面图可用于评估最优特性。

手动响应曲面仅能展示两个因素对所研究响应值的影响。若要揭示其他额外因素对响应值的影响，可通过在因素工具窗口中更改该因素的数值或水平来实现。或者，也可通过在因素工具窗口中右键单击相应因素，并选择所需的自变量坐标轴，将因素分配至图表坐标轴上。

使用因子工具调整因子水平，并将其分配给图形坐标。通过文件选项卡中的“导出图形到文件”命令导出图形。在优化节点中使用数值子节点，根据模型因子对目标响应进行数值优化，且可通过条件选项卡为这些因子施加特定约束。

根据“条件”选项卡中输入的参数，在“解决方案”选项卡中计算并查看数值解。将这些解导出至其他软件（如电子表格），以进行进一步分析，揭示与高或低响应值相关的因素设置。当研究的数值因素超过三个且难以进行三维表示时，此方法在本代表性研究中尤为有用。

采用 DOE 策略来考察不同启动子和五端 RS 对 ds 的瞬时表达的影响。该表格列出了瞬时表达模型中包含的红色因子及研究范围。加粗的因子为本实验所特有的。

斜体表示的因素用于另一个稍后将描述的实验。所有离散数值因子均至少选择三个水平，以便计算二次基础模型。采用 D-最优选择算法来选取实验设计（DOE）的运行次数，以获得回归模型系数的最准确估计值。

最初由设计专家建议的设计包含90次运行，但其FDS不足以达到1%的预测标准误差。将设计最优增补至总共210次运行后，解决了该问题，使FDS达到100%，且设计空间内的预测准确性更加均匀，表现为曲线平坦。针对全部210次运行测定了DS红色染料浓度，并对数据进行了以10为底的对数转换。模型因子通过从立方模型中以0.100的alpha水平进行自动向后选择确定。

这得到了一个具有显著性的模型，其失拟性不显著，且多重相关系数的值较高。模型中所有因素的 P 值均小于 0.05，因此无需对模型进行进一步的人工调整。该模型包含三个因素交互作用（以粗体标出），这些交互作用不属于初始二次基础模型对 FDS 图的重新评估部分。

使用最终预测模型中包含的所有因素发现，增加三因子交互作用后，预测标准误的FDS值并未显著降低。Design Expert中的模型质量诊断工具表明，数据转换是有效的，且模型中无遗漏因素，因为残差的正态图呈现线性行为，残差与预测值图中未观察到特定模式。此外，在整个实验过程中未出现趋势，表明不存在隐藏的时间依赖性变量。

然而，模型预测结果与观察到的Diaz红色荧光高度一致，因为所有数据点均接近对角线。因此认为，所选模型可用于预测在为期八天的浸润后培养期间，由不同启动子5'非翻译区组合驱动的DS红色蛋白在非顶端烟草叶片中的瞬时表达。此外，还选择了一个未进行数据转换的人工线性回归模型，以说明错误的因子选择和数据转换所带来的后果。正如此处明显可见，残差的正态概率图偏离了预期的线性行为，残差与预测值关系图中呈现出V形模式，而非随机分布的散点。

此外，残差与运行序号关系图显示了两个极端值。尽管对于偏离对角线的较小值和较大值，预测效果均较差，但此处展示了烟草叶片中瞬时表达 DS 红色蛋白的最优模型响应面。模型预测表明，叶片年龄是一个显著影响因素，老叶中的表达水平较低，例如图 A 和图 B 中的第二片叶，相较于图 C 和图 D 中的第六片嫩叶。在侵染后八天的培养期间，叶片中 DS 红色蛋白的积累过程既非线性也非指数型，而是遵循S型曲线增长。

与NOS启动子组合相比，5'非翻译区与CAMV 35S启动子的组合导致更强的DS红色荧光蛋白表达。尽管5'非翻译区对DS右侧表达也有显著影响（如TL与CHS之间的比较所示），但表达强度依赖于所搭配的启动子。预测模型还表明，某些启动子与5'非翻译区的组合（如nas-CHS和CAMV 35S-CHS）可在所有叶片及超过两天的孵育时间内，实现表达水平的平衡，其差异小于设定比例的30%。

这种平衡表达对于具有确定化学计量比的多聚体蛋白的表达非常有用。DOE 方法还被用于优化在烟草中同时生产 G12 和 DS red 蛋白的培养条件和收获方案。本实验中所包含的影响瞬时表达的因素有：600 纳米光密度（od 600 nanometers）和培养时间。

建立了预测每种蛋白质在不同生长阶段植物中表达水平的模型。幼叶在播种后40天采集，老叶在播种后47天采集。随后对这四个模型进行评估，并建立包含各个单独模型中显著因子的共识模型。

随后证实，该共识模型仍然是所有初始数据集的良好表征。该共识模型被进一步用于确定两种蛋白的最佳孵育温度及细菌在600纳米处的OD值，以预测幼嫩和成熟植株中所有叶片及其叶位的蛋白浓度。将浓度分布数据与生物量数据整合后，最终获得蛋白的绝对产量。

随后将绝对蛋白含量与相关的下游成本进行关联，从而对每株植物不同生长期叶片的加工进行成本效益分析。与老熟植株相比，尽管幼嫩植株的平均生物量约低50%，但其中DS red的含量相当，且G 12的含量约为前者的65%，表明幼嫩植株具有更高的特异性蛋白表达水平。这表明，尽管幼嫩植株的总体生物量较低，但由于在较短的生长周期内蛋白浓度更高，因此更适合用于瞬时表达。

最后还发现，处理老植株的全部叶片比丢弃前三个叶片并相应增加每批次植株数量的成本更高。因此，基于 DOE 的模型不仅适用于标记实验的最终步骤，还可与其他数据结合，以促进工艺分析中更复杂环节的实现。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计、实施并分析一项 DOE，以研究植物中瞬时蛋白表达。