活体或固定染色样本的光片荧光显微镜成像 赤拟谷盗 胚胎

本实验方案的总体目标是对赤拟谷盗（Tribolium castaneum）胚胎在很长一段时间内进行非侵入性的发育观察。基于光片的荧光显微技术有助于回答新兴昆虫模式生物赤拟谷盗在形态发生过程中涉及的问题，例如从早期囊胚到肌肉运动开始阶段的细胞迁移和增殖模式。该方法的主要优势在于，即使对胚胎进行数天的连续观察，仍能将光漂白和光毒性等关键影响因素降至最低。

使用琼脂糖柱将胚胎装入样品室时，首先用一毫升注射器吸取蒸馏水，并使用一小段橡胶软管将注射器连接至玻璃毛细管。将毛细管半充满蒸馏水，然后用画笔将胚胎转移至玻璃毛细管开口的内侧，再将毛细管缓慢插入液态琼脂糖中，同时吸取数微升琼脂糖连同胚胎进入毛细管内。当胚胎就位后，其上下方均应保留数微升琼脂糖。

当琼脂糖凝固后，将毛细管截短至约五毫米长。剩余的片段应完全充满琼脂糖，且胚胎应位于第二象限内。然后将带针的钢制圆筒插入样品室，并将毛细管片段顶端固定在针上，使琼脂糖柱从含有胚胎的毛细管片段区域向外突出几毫米。

使用琼脂糖半球将胚胎装入样品室时，首先用1毫升注射器吸取200微升液态琼脂糖，并通过注射器从钢管顶部向带有样品室的钢管内注入琼脂糖，直至其底部开口处形成半球形。待琼脂糖凝固后，用画笔尖挑取一个胚胎，并调整胚胎位置，使其前端易于接触。将琼脂糖半球浸入液态琼脂糖中，使其表面覆盖一层薄薄的琼脂糖膜，然后将胚胎前端朝上放置于琼脂糖半球的极点位置。

转动钢管，并根据需要使用毛刷调整胚胎的位置。理想情况下，胚胎表面被琼脂糖覆盖的部分应少于一半，且两侧应尽可能陡直。胚胎表面覆盖过多琼脂糖会导致机械性收缩，并减少气体和离子交换，从而显著影响胚胎的存活率。

然后缓慢将钢管插入样品室。使用蛛网支架将胚胎装入样品室时，首先用毛笔挑选一个胚胎，并将毛笔放置一旁。接下来，用5至8微升液态琼脂糖覆盖蛛网支架的槽孔，随后去除大部分琼脂糖，仅保留一层薄薄的琼脂糖膜。

将胚胎放置在琼脂糖薄膜上，仔细调整其位置，使胚胎位于狭缝孔的x轴中心，并将其伸长的前后轴与狭缝孔的长轴对齐。确保在琼脂糖涂布后10–15秒内将胚胎放置到琼脂糖薄膜上，此时琼脂糖仍处于液态，否则胚胎无法牢固附着。然后缓慢将Cobweb固定器插入样品室，调整固定器的位置，避免干扰激发光和发射光。

进行活体成像实验时，首先设置时间序列，然后在透射光模式下将胚胎沿 X 轴和 Y 轴移动至视野中心，注意避免胚胎暴露于激光下。以 90 度为步进，将胚胎旋转 360 度，检查组织在制样过程中是否受到任何损伤。在荧光模式下，为每个方向定义 Z 轴层扫范围，在胚胎前后各增加 25 至 50 微米的空间缓冲，并设定 Z 轴步距。

为进行长期成像，需确保样品室中加入足量的成像缓冲液，并覆盖样品室开口。随后启动成像过程，对所有胚胎在各通道、各方向上的成像采集情况进行监控，确保采集正确无误。成像结束后，将样品架从样品室中取出，并将胚胎转移至载玻片上。

如果使用了琼脂糖柱，需用锋利的刀片将胚胎从周围的琼脂糖中切出。如果使用了琼脂糖半球，则将平面朝下转移至载玻片上。对于蛛网支架法，使用画笔轻轻将胚胎从琼脂糖膜上取下。

然后将载有胚胎的载玻片置于小型玻璃培养皿中，在饱和湿度环境下，于标准条件下孵育，直至幼虫孵化。为处理所观察胚胎的数据，使用相应的成像分析软件打开感兴趣的文件，并根据需要旋转Z层扫描图像，使胚胎的前后轴与Y轴对齐。沿X轴和Y轴裁剪Z层扫描图像，使仅保留最小背景，然后对每个Z层扫描图像计算Z轴最大投影。

然后根据转基因品系和成像方式，对时间序列图像进行适当的动态强度调整，以校正光漂白或因表达波动引起的背景变化（如有必要）。利用一种在α-tubulin1启动子调控下表达组蛋白2B与M-Emerald融合蛋白的转基因品系，在室温下对胚胎发育66小时的过程进行了记录，从胚带收缩阶段直至背闭合阶段。该增强子捕获品系可用于观察头部附肢内的神经元簇以及背闭合过程中神经索迁移的动态过程。

成像另一条携带相同转基因但插入基因组不同位置的转基因品系，其从原肠胚形成期到胚带伸长期的过渡阶段的光学切片可显示新生胚带的内部细胞排列。利用胶质细胞-蓝色（glia-blue）转基因品系，通过旋转样品并沿多个方向获取Z轴层扫图像，可在同一胚胎中观察到腹神经索沿线及周围胶质细胞的重排过程，以及头部叶背侧胶质细胞的增殖动态。小分子荧光染料也可用于特异性标记细胞间结构，以突出显示某些胚胎特征，例如尾部环状结构、后腹侧环状细胞，或在浆膜窗闭合过程中出现的浆膜-羊膜-胚带组织三层结构。

双色荧光染料染色可进一步可视化同一胚胎中的两种细胞间结构，例如肌动蛋白细胞骨架和核膜。记录完成后，为确保实验的质量控制，需回收胚胎并将其培育至健康且具有生育能力的成体。

该实验步骤可与其他技术（如亲本RNA差异分析）结合，用于分析基因敲低后的表型。