高通量定量表达筛选与纯化技术应用于在大肠杆菌（E. coli）中表达的重组二硫键富集型毒液蛋白

以下实验方案的总体目标是利用高通量表达筛选流程，通过自动化液体处理机器人在大肠杆菌中定量可溶性蛋白的表达水平。该流程首先将转化了编码目标融合蛋白质粒的细胞接种至96孔预培养板中。次日，将含有自动诱导培养基的24孔板用前一晚的预培养菌液接种，以启动蛋白表达。

收获培养物后，从表达培养物中冻存可溶性蛋白，再通过固定化金属亲和层析进行纯化。最终，可测定每种完整目标融合蛋白的溶解度水平，以确定蛋白质生产的最佳表达条件及成功靶点的生成。相较于传统方法，该技术具有效率更高、批次间差异有限以及数据处理与追踪简便等优势。该方法的可视化演示至关重要。

自动化步骤仅以文本形式呈现时可能显得令人生畏且难以理解，因为文本无法传达该操作的速度或简便性。在细菌转化开始后，首先使用机器人夹具将第一个24孔LB琼脂平板的盖子移开。接下来，使用八通道液体处理臂从96孔转化板中混合并吸取50 µL转化混合液。

将液体处理臂前四个通道中的转化混合物加入LB琼脂平板的第一列，后四个通道中的转化混合物加入LB琼脂平板的第二列。加样后彻底清洗所有吸头，然后继续将96孔板中的转化混合物转移至LB琼脂平板接下来的四列所有孔中，直至该平板完成。第一块平板的转移完成后，盖上盖子，开始下一块平板的转移。所有转化样品接种完毕后，以1200 RPM振荡所有平板一分钟，使转化混合物均匀分布。

混匀后，使用96道移液臂从96孔板中吸取剩余转化混合物60微升，并将其加入含有LB肉汤的深孔96孔板中。用透气性胶膜密封深孔96孔预培养板，以保证培养过程中的通气，随后将该板置于37摄氏度摇床培养箱中，以最大转速过夜培养。预培养板放入培养箱后，将LB琼脂平板在生物安全柜中打开皿盖干燥约10分钟。

然后将平板倒置，于37摄氏度培养箱中过夜培养。次日，使用液体处理臂将过夜预培养物各100微升转移至深孔96孔板中，按1:40的稀释比例接种表达培养物，操作方案与之前相同，并在每次处理预培养物的不同列之间，于清洗站彻底清洗液体处理臂。接种完成后，将表达培养物置于37摄氏度摇床培养箱中，密封透气胶带，培养四小时。

然后将温度降至17摄氏度，过夜培养。次日早晨，将24孔深孔板在3000 ×g 条件下离心10分钟。将上清液弃入含有抗菌剂的废液容器中，然后将孔板倒扣在吸水纸上轻拍，以去除残留培养基，确认培养物生长正常。检查深孔中是否有菌体沉淀形成。

接下来，吸取125微升裂解缓冲液，使用四个吸头将缓冲液分两次加入深孔24孔板的每个孔中。为达到重悬沉淀物所需的1毫升裂解缓冲液终体积，将板子在1200 RPM条件下震荡5分钟。在机器人上，将细胞悬液转移回深孔96孔板中对应的孔内，并将板子密封后于-80摄氏度保存至少1小时。

本实验演示中，我们将使用50 µL镍珠来纯化目标融合蛋白。首先，在水浴中解冻深孔96孔板，约15分钟。然后，在摇床培养箱中以最大速度重新悬浮细胞裂解物，继续孵育10分钟，此时菌液应变得黏稠。

接下来，使用手动八通道移液器将 DNA 和硫酸镁溶液分别加入深孔 96 孔板的每个孔中，使其终浓度分别为 10 微克/毫升和 20 毫摩尔。密封后继续震荡培养板 15 分钟，此时菌液应不再具有黏稠性。为避免纯化过程中滤板堵塞，必须仔细肉眼检查，确保所有裂解液均不再黏稠。

在液体处理机器人上，使用 200 微升宽口吸头在转移 200 微升树脂悬液之前充分混匀。将 200 微升树脂悬液转移至含有裂解液的深孔 96 孔板中。在 1400 转/分钟及室温条件下振荡深孔 96 孔板 10 分钟，以促进结合。随后使用宽口吸头混匀树脂-裂解液悬液，并将全部 1200 微升悬液以每份 200 微升分批转移至滤板上。接着开启真空约 30 秒，使裂解液通过滤板过滤，并将滤过液收集至深孔板中。

将含有穿流液的96深孔板从滤板下方移除，并放置于架子上保存，直至实验结束。随后，每次用800 µL结合缓冲液对树脂清洗两次；第二次清洗后，使用机器人夹具在滤板下方放置一个新的96深孔板，用于收集50 mM咪唑洗脱液。向滤板中加入150 µL洗涤缓冲液，再次施加真空，直至缓冲液完全通过含有树脂的96深孔板。

从滤板下方移除的洗涤液被收集并置于架子上，保存至实验结束。随后，用800微升洗涤缓冲液再洗涤两次，操作方式与结合缓冲液的洗涤步骤相同；洗涤完成后，使用机器人夹具将微孔板转移至工作台，并将SPE柱块和滤板重新放回微孔板上方，以收集洗脱液。然后，向滤板中的树脂加入190微升洗脱缓冲液。

三分钟后，施加真空一分钟，使所有缓冲液完全通过。迅速目视检查 Ellucian 加样体积是否正确。最后，收集 Ellucian 洗涤液和流穿液样品，用于可溶性表达水平的定量分析。

首先分析ellucian板，仅在必要时检测相应的洗涤和流穿组分。这些数据展示了Caliper Lab Chip系统获得的电泳结果。完整的切割后融合蛋白由上方条带表示，而切割产生的蛋白片段则由下方条带表示。

每种目标蛋白的融合产量分别处于每升培养液0.1至2、2至10以及10至25微克的范围内，在某些情况下则未检测到。通过各融合蛋白片段中二硫键的数量来评估蛋白表达的成功率，结果显示，对于所有测试数量的二硫键，表达均取得了合理成功，其中含有六个二硫键的目标蛋白成功率最低，为66%。基于等电点和残基数对表达成功率分布进行分析，表明该技术无明显偏好性，成功表达的目标蛋白和未检测到的目标蛋白在图中分布广泛。

在检测到融合蛋白并进行切割后，纯化的目标产物需通过电喷雾电离质谱法进行质量控制。此处展示的代表性目标蛋白是一种分子量为5.7千道尔顿、富含二硫键的毒液蛋白，含有四个二硫键。该谱图显示的是蛋白在切割和脱盐后、但尚未用DTT还原时的检测结果，未进行其他干预处理。

该谱图显示了蛋白质经DTT还原并脱盐以去除过量DTT后的结果。箭头指示对应于实验质量的离子，每种离子的标识以绿色标出。表中列出了这些离子计算得到的实验母离子质量，其质量差为8道尔顿，相当于四个被氧化的二硫键。

建立后，可在一周内对一千多个培养物进行完整的实验流程。观看本视频后，您应能充分掌握如何利用小规模的大肠杆菌培养，通过高通量方法确定可溶性蛋白表达所需的成功条件。