基于纳米颗粒示踪分析的单个细胞外囊泡在人血中快速荧光表征

该方法解决了本领域中的一个常见问题，提供了一套完整的流程，用于快速分离和表征具有特定目标标志物的单个细胞外囊泡。纳米颗粒示踪分析是一种半自动化方法，利用光散射特性和布朗运动来分析细胞外囊泡的粒径分布。

本实验操作将由本实验室的博士研究生 Vera Schmidt 演示。分离细胞外囊泡时，先将两毫升人全血样本收集至血清分离管中，在室温下静置15分钟使样本凝固，然后通过离心分离细胞与血清。将每个样本中的1毫升血清转移至独立的1.5毫升离心管中，进行离心以去除血小板，再将100微升去除了血小板的血浆转移至新的1.5毫升离心管中。

接下来，向血浆中加入25 µL外泌体沉淀溶液，并充分涡旋混匀样品。在冰上孵育30分钟后，通过离心收集细胞外囊泡。沉淀物呈米色或白色。

吸弃上清液，再次离心样品。然后，彻底去除残留液体，并将沉淀重悬于 100 µL 的 PBS 中。为了对囊泡的细胞膜进行染色，将 10 µL 的 EV 悬液加入 50 µL 新鲜配制的 PKH67 乙醇染料溶液中，并充分混匀。

在避光、室温条件下静置5分钟后，将50微升染色的细胞外囊泡悬液加入至15毫升锥形管中，用2.5毫升蒸馏水稀释，并充分混匀。为使用抗体标记囊泡，将10至20微升未染色的细胞外囊泡悬液加入1.5毫升反应管中，用50微升蒸馏水稀释，并充分混匀。随后向反应管中加入2.5至5微升目标抗体，充分混匀，在避光、室温条件下孵育30分钟。

然后，将50微升标记的囊泡转移至含有适量蒸馏水的15毫升锥形管中，充分混匀，具体体积参见表格。在分析染色或标记的细胞外囊泡之前，首先将荧光滤光片移入显微镜和相机的光路中，并根据屏幕上的提示启动程序，进行自动化操作。在“Cell Check”选项卡下，选择正确的细胞数量用于荧光测量，并设定光学系统的参考位置，以确认激光器与显微镜处于同一焦平面。

使用注射器用 10 毫升蒸馏水冲洗细胞通道，注意确保测量池中无气泡，且避免将气泡注入系统中。接下来，将 10 微升 200 纳米荧光标记的聚苯乙烯颗粒稀释于 990 微升蒸馏水中，并取 10 微升该颗粒悬浮液加入含有 10 毫升蒸馏水的 15 毫升离心管中。然后，将 2.5 毫升第一次稀释的颗粒溶液注入细胞通道，并点击“优化焦距”以调节相机。

为测量样品，先用10毫升蒸馏水多次冲洗细胞通道，然后注入染色的细胞外囊泡悬浮液。在“Cell Check”选项卡中，根据参考位置和下表所示，调整适当的采集参数。为确定最佳灵敏度范围，点击“粒子数量 vs.”

灵敏度，用于显示不同灵敏度水平下每屏幕检测到的粒子数曲线。对于快门参数，调节相机允许光线通过的时间周期。在后采集参数中，选择最小亮度为20，最小粒径为20纳米，最大测量粒径为500纳米。

记录显示视野中检测到的颗粒数量。散射条应处于绿色至橙色范围，即50至300个颗粒之间。点击“在零电压下检查颗粒漂移”并打开“测量”选项卡。

单击“运行视频采集”，将实验次数设置为三到五次，实验间时间间隔设置为零分钟。将每个待分析颗粒的测量位置的独立子体积位置数设置为11，每个测量位置的测量循环次数设置为10。然后，选择一个文件夹，创建新的文件名，单击“确定”以开始测量。

分析结束后，打开“分析”选项卡以查看结果。随后检查每个位置的平均颗粒数、被追踪颗粒的总数及颗粒浓度、颗粒的分布宽度，以及平均值和标准差。使用荧光微球进行测量的调整与校准，可获得85%的最佳设置灵敏度。采用这些设置时，相机显示清晰的图像，且重复测量显示出较低的标准差。

使用细胞连接试剂盒进行染色，该试剂盒包含一种带有长链脂肪族尾部的绿色荧光染料，可插入细胞膜的脂质区域，结果显示灵敏度与检测到的颗粒数量之间存在强相关性。针对目标蛋白的细胞外囊泡染色抗体显示颗粒分布范围为220至1,145纳米，峰值最大尺寸为541纳米。在对无囊泡的对照水样进行抗体染色后，未检测到任何细胞外囊泡，检测灵敏度接近100%。若在漂移速率大于每秒5微米时开始测量，各次重复实验将表现出明显的偏差。

需要注意的是，使用异硫氰酸荧光素作为荧光染料会导致不准确且不可重复的测量结果，因为该荧光染料容易发生快速光漂白。本方案针对该领域许多研究人员对利用特异性标记物快速表征单个细胞外囊泡的主要需求而设计。尽管在过去十年中相关方法已得到显著改进，但目前仍缺乏用于单个细胞外囊泡分析的标准化操作流程。

无论细胞外囊泡生物学研究在未来如何发展，该方法均可利用特异性标记物对单个细胞外囊泡进行快速且可靠的表征。由于我们目前的实验方案不涉及较长的处理时间或耗时费力的步骤，因此也适用于高通量样本分析。