使用开尔文探针力显微镜测量细菌的表面电势

以下实验的总体目标是观察微生物在黏附于不同材料基底后细胞膜电荷的变化。首先将微生物在营养丰富的培养基中培养，以增加其数量。随后，对微生物将要黏附的材料表面进行清洗和功能化处理，以实现最佳的微生物附着率。

然后将微生物接种在不同材料基底上，以进行开尔文探针力显微镜（KPFM）成像。结果显示，材料基底的类型及其固有电荷会影响细胞活性，表现为细胞膜电荷和细胞黏附性的变化。与现有的电泳、光散射和等电点测定等方法相比，该技术的主要优势在于，KPFM能够检测单个细胞和生物膜的电荷，而非仅限于整个培养物或菌落。

这在需要高准确度和高精确度地比较细胞间以及生物膜电学特性时具有优势。首先，制备5%羊血琼脂平板，将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）细菌划线接种至已制备的平板上，并在37摄氏度下培养24小时，以获得单个分离良好的菌落。配制500毫升胰蛋白胨大豆肉汤，添加1%葡萄糖和0.1%氯化钠，连同两支洁净的玻璃试管和一盒1毫升移液器吸头一起进行高压灭菌。

在生物安全柜内或本生灯旁使培养基和试管冷却后，用移液器向每支试管中加入六毫升TSB。取一块先前制备的绵羊血琼脂平板，将一株MRSA单菌落接种至其中一支试管中。将第二支试管作为空白对照，以确保无菌状态。将试管置于往复式摇床培养箱中，在37摄氏度、200转/分钟条件下培养24小时。

MRSA 管应显示有菌生长，而对照试管中则应无任何生长。接下来，取 24 小时培养物中的 1 毫升接种于 6 毫升新鲜胰蛋白胨大豆肉汤中，制备亚培养物，并在 37°C、200 RPM 条件下继续孵育 6 小时。然后，将 1 毫升培养物转移至 afus 管中，在 850 × g 条件下离心 3 分钟。

去除上清液，用去离子水清洗沉淀物两次，操作时用优势手持镊子。手持一个20毫米的不锈钢FM样品盘，用5毫升去离子水清洁每一面。将清洁后的样品盘放入盛有去离子水的烧杯中，超声处理一分钟，超声结束后继续后续操作。

用镊子将样品圆片从烧杯中取出，并将其以约60度的角度倾斜靠在铺有纸巾的开放培养皿边缘，使其干燥。干燥完成后，用培养皿盖盖住圆片以完成彻底干燥。干燥后，将圆片转移至培养皿中，以对圆片表面进行功能化处理。在生物安全柜中，用移液器将200至400微升的0.1%多聚赖氨酸滴加到圆片上，并用镊子夹持圆片，在室温下孵育一小时。

用去离子水清洗，具体操作如本视频前面部分所示。接下来，将经过两次洗涤后重悬的细胞取 200 至 400 微升，接种到包被的样品圆盘上。在室温孵育 30 分钟后，用 1 毫升去离子水轻轻清洗圆盘。

在进行开尔文探针力显微镜成像前，让样品盘干燥过夜。打开计算机、原子力显微镜（AFM）、HEB 和 MAC 三控制器。启动原子力显微镜成像软件，例如 Ulence P ovu 概览软件。

选择 A-C-A-F-M 或间歇接触模式成像的正确标识。用优势手持 FM 镊子，另一只手握住弹簧加载的探针夹持器使其保持打开状态，小心地将 A-K-P-F-M 悬臂插入探头组件中。小心地将探头组件装入 A FM，并连接激光光源和载物台升降电机的导线。

然后将激光对准悬臂的尖端。为将激光对准悬臂尖端，顺时针旋转前后调节旋钮数次，使激光移动到悬臂芯片的上方。

当激光到达芯片时，将被遮挡而不再可见。然后逆时针旋转前后调节旋钮，直至激光光斑重新出现。此时激光已对准芯片边缘。

旋转从左到右的旋钮，将激光对准悬臂。当激光经过悬臂时，会快速地消失并重新出现。激光光斑应能在磨砂玻璃盖上可见，该位置即为后续放置光电二极管组件的位置。

逆时针旋转前后调节旋钮，使光斑沿悬臂向针尖方向移动，直至磨砂玻璃上的光斑消失。然后仅轻微顺时针旋转前后调节旋钮，调整激光位置，使其恰好位于悬臂针尖处，此时激光光斑将重新出现在磨砂玻璃上。激光对准后，将样品台升降电机保持在开启位置10秒，以确保悬臂与样品之间有足够的空间。

将样品安装到原子力显微镜（AFM）时，现在将样品放置在开尔文探针力显微镜（KPFM）样品台上。使用铜线将样品接地，并将AFM的相应导线连接到样品台。然后在AFM软件中将样品台连接到AFM。

确保设定时间不超过10毫秒，接近速度不超过每秒2微米。为避免探针损坏，需先调节悬臂梁，然后开始将悬臂梁探针移向样品。当悬臂梁探针到达样品表面后，选择成像窗口尺寸和理想的成像区域，优化眼图增益（eye gain）和P增益，同时调整悬臂梁设定点，以优化形貌成像效果。

当形貌成像优化后，开启FM模式下的KPFM模块。将成像窗口设置为5微米×5微米，分辨率为512×512，或采用慢速扫描。对于FM-KPFM参数设置，将驱动幅度设为5%至10%，驱动频率设为1至5千赫兹，带宽为2千赫兹。

将F-M-K-P-F-M的铁纳米颗粒增益设置为0.3%。在获取KPFM图像后，使用图像后处理软件，按照本视频演示中所述的设置对图像进行分析，并收集SP数据。KPFM图像分别在不锈钢和金表面上的15个耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）细胞上采集。此处展示的是所采集的图像类型。

由于开尔文探针力显微镜（KPFM）采用双频率工作模式，因此可同时采集细胞表面的形貌图像和电学数据。对表面电势图应用了热滤波处理，以更清晰地识别表面电势的微小变化。在本图中，通过分析图像确定微生物膜表面电势，并进一步用于比较不同底物上的生长情况。

对裸露的不锈钢和裸露的金基底进行的表面电位扫描显示，其表面电位总体为负。经聚醇赖氨酸包被的不锈钢和金圆片均表现出向正表面电位的转变。MRSA细胞膜电位在不锈钢和金表面之间有所不同。

与在表现出负表面电位的金基底上的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）细胞相比，不锈钢基底上的细胞表现出显著更大的正膜表面电位。为了展示开尔文探针力显微镜（KPFM）的全部功能，此处展示了MRSA在不锈钢上的台阶高度图示例。该图显示了基底表面与微生物膜之间表面电位的差异。

观看本视频后，您应能充分理解如何使用开尔文探针力显微镜来研究电荷对微生物细胞在不同材料基底表面附着及活性的影响。