人类心脏组织制备自组装细胞外基质水凝胶的处理方法 体外 和 体内 应用

本实验的总体目标是将心脏细胞外基质加工成水凝胶，从而能够在各种基于细胞的检测中研究该基质的作用。该方法有助于回答心脏研究领域中的关键问题，例如细胞外基质如何影响细胞行为。该技术的主要优势在于，它便于在体外或体内大规模实验中使用细胞外基质。

该技术的应用可拓展至心肌梗死的治疗，因为该基质能够提供关键的存活信号。实验开始时，使用带有10号刀片的无菌手术刀，去除先前获取的左心室心肌组织中的脂肪组织。使用手术刀将心肌切成约1 cm × 1 cm × 1 cm的立方体。

接下来，将组织块放入无菌的50 mL离心管中。将含有组织块的离心管于-80摄氏度保存。从冷冻机中取出装有已制备组织块的离心管，并置于冰上运输至冷冻切片机。

将冷冻切片机的样本头和样本室温度设置为15摄氏度。将空的50 mL离心管和样本托置于样本室内预冷。在冷却的样本托上添加一层冷冻切片包埋剂，并使其冷冻至变白且凝固。

加入第二层冷冻切片包埋剂，并将心肌管放入第二层中。确保冷冻切片包埋剂和心肌完全冻结。然后，将带有冻结心肌的印模插入持架中，并拧紧所有螺丝。

修剪组织表面，直至获得平整的切片面。使用自动切片法对冷冻的心肌组织进行切片，以确保切片厚度均匀。每个组织块大约可切出30至40片切片。

切片完成后，将每个切片轻轻放入预冷的 50 mL 离心管中。盖紧装满切片的离心管，并置于冰上。将所有 50 mL 离心管中的冷冻切片转移至一个无菌烧杯中。

向含有心肌片的 50 mL 离心管中加入 50 mL 裂解液。接着，在无菌烧杯中振荡心肌片。用粗滤筛过滤液体和组织片。

然后，用钝头镊子将组织切片转移至一个新的无菌烧杯中。每50 mL初始心肌切片管加入50 mL含0.5% SDS的PBS溶液。在室温下以100–150 rpm持续振荡烧杯6小时。

振荡后，用粗滤器将液体连同组织切片一起过滤。用钝头镊子将组织切片转移至新的无菌烧杯中，并用 50 mL PBS 洗涤切片三次。接着，用含 1% 青霉素-链霉素和 1% 制霉菌素的 PBS 将切片在4°C 过夜洗涤。

第二天，移除洗涤液，向每管初始体积为50 mL的心肌片脱细胞切片中加入25 mL预热至37摄氏度的FBS，并含有1%青霉素-链霉素和1%制霉菌素。在37摄氏度下孵育切片3小时，以去除基质中残留的任何DNA。然后将切片转移至新的无菌烧杯中，用50 mL PBS洗涤3次。

将细胞外基质（ECM）切片松散地放入新的无菌六孔板中。在 -80 °C 下冷冻细胞外基质，并在冻干机中冻干两天。为粉碎 ECM 切片，请使用含有 1.4 mm 陶瓷珠的研磨管。

使用无菌钝头镊子将冻干的细胞外基质松散地装入离心管中。将离心管在液氮中快速冷冻。将冷冻的离心管插入研磨机中，粉碎细胞外基质。

设置时长为30秒，调节至最大速度，然后启动设备。研磨完成后取出管子，再次在液氮中速冻。通过每管加入1 mL ddH2O将微粒从管中冲洗出来，并振荡以确保完全溶解。

然后，将非均相溶液通过200微米筛网过滤至50 mL离心管中。将离心管置于液氮中速冻。将离心管的普通管盖更换为0.22微米滤器，以防止粉末从管中逸出。

将试管放入冻干机中，再次冻干以去除洗涤步骤中的水分。将先前制备的冻干人细胞外基质粉末溶解于胃蛋白酶溶液中，终浓度为每毫升10毫克。将溶液转移至2 mL试管中，每管体积为1 mL。

用移液器吹打溶液以充分混匀。接着，将试管放入摇床中，在27摄氏度下以1200 rpm振荡48小时。振荡结束后，将试管从摇床中取出，置于冰上或预冷的试管架中。

在预冷的离心管中，将体积为ECM溶液1/9的冷10倍浓度PBS与体积为ECM溶液1/10的冷0.1摩尔氢氧化钠溶液混合，并置于冰上，以中和消化后的ECM溶液并灭活胃蛋白酶。最后，将ECM溶液加入中和混合液中，通过移液或涡旋充分混匀。针对单个ECM组分的定量分析显示，与单独使用SDS进行脱细胞相比，该方法可更彻底地去除DNA，并更好地保留总胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖。

采用RT-PCR技术定量分析小鼠胚胎干细胞在自发分化过程中结构型心肌细胞蛋白、早期及晚期心肌生成转录因子以及内皮细胞表面标志基因的表达。与cECM接触可促使多能干细胞更倾向于向类似心肌细胞的表型分化。相差显微镜观察显示，将cECM进行48小时的酶消化后，可获得更为均一的细胞外基质溶液。

在cECM水凝胶上对人源心肌成纤维细胞进行活/死染色，显示细胞存活率提高。与标准培养条件下的细胞相比，在缺血条件下，cECM微粒和cECM水凝胶均可增强收缩性HL-1细胞的代谢活性。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一周内完成从组织到水凝胶的制备。

该技术问世后，为心脏再生领域的研究人员探索心肌细胞外基质在体外和体内模型系统中的作用奠定了基础。