制备肾皮质细胞外基质来源水凝胶

该方法有助于解答生物材料领域中的关键问题，例如细胞基质相互作用如何影响硫酸化。该技术的主要优势在于，它能够生成首个准确反映天然肾皮质生化微环境的材料。在组织培养超净台内铺上吸水垫。

将一个含有搅拌子的一升烧杯、一个150毫米的无菌组织培养皿以及整个肾脏放入生物安全柜中。向烧杯中加入500毫升1% SDS溶液。将肾脏放入无菌组织培养皿中。

用手术刀轻轻刮除肾包膜周围的肾周脂肪。然后，在肾脏上端横向做一个8至10厘米的浅切口，以打开肾包膜，同时避免损伤下方的皮质组织。使用两把止血钳通过从皮质组织上剥离的方式去除肾包膜。

使用手术刀沿肾脏外侧冠状面将肾脏切为两半。用手术刀剔除髓质区域，从两半肾脏中分离出皮质组织。随后将皮质组织切成0.5立方厘米大小的碎块，并去除任何可见的较大血管。

为了从肾脏中分离细胞外基质，将切碎的皮质组织放入含有SDS溶液的烧杯中。用经高压灭菌的铝箔覆盖烧杯，并将其置于搅拌器上，转速约为400 RPM，在组织培养罩外搅拌。持续搅拌24小时后，将烧杯移入组织培养罩内。

加入一个由尼龙网制成的40微米无菌细胞筛。然后，用200毫升漂白剂填充另一个1000毫升烧杯，并将其放入组织培养罩内。通过细胞筛将SDS溶液弃入含漂白剂的烧杯中。

用移液器吸出残留的SDS溶液，直至烧杯中仅剩脱细胞组织和细胞筛网。将细胞筛网留在烧杯中，加入500毫升新鲜SDS溶液。用相同的铝箔覆盖烧杯，并以与之前相同的速度置于搅拌台上。

脱细胞并洗涤后，将脱细胞组织（此后称为肾脏ECM）转移至一个30毫升的直立锥形管中，并加入细胞培养级水，直至完全浸没所有组织。首先，使用组织匀浆器在锥形管中对肾脏ECM进行匀浆处理2分钟，直至获得无可见ECM碎片的不透明溶液。

然后，将含有肾脏细胞外基质（ECM）的锥形管浸入液氮中，直至锥形管周围不再有沸腾现象。将肾脏细胞外基质在负4摄氏度条件下保存过夜。为了冻干已冷冻的脱细胞组织，需略微松开锥形管盖以允许气体交换，并将该管放入冻干机中。

将肾脏ECM冻干三天，或直至其呈现为细小的白色粉末状。为进行化学消化并使凝胶溶解，向含有搅拌子的闪烁瓶中加入精确称量的猪胃蛋白酶和0.01 N盐酸。以约500 RPM的速度搅拌，直至所有蛋白酶完全溶解。

然后，将冻干的肾脏ECM转移至闪烁瓶中，并将溶液置于搅拌台上，以约500 RPM的速度搅拌三天，以制备储存用肾脏ECM水凝胶。在组织培养超净台中，用移液器将所需体积的细胞培养基、一种正常氢氧化钠溶液和M199补充剂加入无菌的30毫升直立式锥形管中。使用微型刮勺混合中和试剂溶液。

使用无菌的1毫升注射器将适量的储存肾ECM水凝胶转移至中和试剂溶液中。用微量刮勺轻轻搅拌溶液，直至获得颜色均匀的水凝胶溶液。搅拌时应缓慢轻柔，避免引入气泡。

为了将细胞掺入肾ECM水凝胶中，每份水凝胶需用10微升培养基重悬三十万个细胞。将10微升细胞悬液加入最终的肾ECM凝胶中。用微型刮勺搅拌溶液，直至细胞均匀分布。

使用1毫升注射器将肾细胞外基质水凝胶注入所需的细胞培养装置中。在将细胞接种或转移至细胞培养装置中的肾细胞外基质水凝胶之前，于37°C下孵育一小时以使凝胶固化。通过质谱法对脱细胞皮质组织进行分析，发现其中含有与基底膜相关的蛋白质，其中以IV型胶原和I型胶原的含量最为丰富。

在所有基底膜中普遍存在的胶原蛋白-IV 的 A1 和 A2 链均被保留。仅存在于肾小球基底膜中的胶原蛋白-IV 的 A3 和 A5 链也被检测到。同时检测到常见的层粘连蛋白和胶原蛋白-I 的同工型。

在胶原蛋白-I、肾脏细胞外基质（ECM）以及两者1:1混合凝胶上培养的人肾小管周围微血管内皮细胞（HKMECs）表现出表型差异。在胶原蛋白-I上培养的HKMECs显示出均匀的CD31表达（红色所示）；而在含有肾脏ECM的两种凝胶上培养的HKMECs则表现为CD31表达降低且分布不均。

基质类型似乎不影响VWF的表达，VWF以绿色显示。在进行此操作时，重要的是要记住充分匀浆脱细胞肾脏皮质组织。此外，在将凝胶与中和试剂混合时，应避免引入气泡。

微生理系统可在受控的实验室环境中用于研究器官功能。此类系统的构建需要细胞、基质和刺激因素的共同参与。本文制备的kECM水凝胶将使我们能够研究模拟肾脏微环境的此类系统。