RNA结合蛋白的检测方法 体外 脂肪细胞培养中的RNA下拉实验

本实验的总体目标是从棕色脂肪组织中分离特定RNA转录本的RNA结合蛋白。该方法有助于回答该领域的一些关键问题，例如，长链非编码RNA的调控机制是什么，以及与其相关的RNA结合蛋白有哪些。该方法的主要优势在于操作简便。

用于演示该实验流程的 RNA 是抗原受体 3' 非翻译区的一个片段，下文简称为 AR 3' UTR。首先以 T7 AR 寡核苷酸和 psiCHECK-2 质粒中的萤火虫荧光素酶部分序列为模板进行扩增。所用引物及反应参数详见随附文档。

扩增完成后，使用PCR产物作为模板，按照制造商说明书，利用体外转录试剂盒合成生物素标记的RNA。然后在37摄氏度下孵育混合物4小时。体外转录结束后，向反应体系中加入1 µL DNase，在37摄氏度下孵育15分钟，以降解模板DNA。

然后，加水将总体积调至 60 微升。将生物素标记的 RNA 加入纯化柱中，以去除盐分和未掺入的核苷酸。随后，测定 RNA 浓度，并将 RNase 在 -80 摄氏度保存，用于后续的拉下实验。

在检测当天，将冻存的生物素标记RNA置于冰上解冻。然后，为了确保目标RNA具有正确的二级结构，将其50微升在90摄氏度加热2分钟，再于冰上冷却2分钟。

接下来，加入 50 µL 的 2X RNA 结构缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟，使 RNA 折叠。随后，通过短暂涡旋振荡使链霉亲和素包被的磁珠在原瓶中重悬。然后，将 150 µL 重悬的磁珠转移至一个 1.5 mL 离心管中。

将离心管置于磁力架上静置一分钟，使磁珠与上清液分离。使用移液器吸除并弃去上清液，保留磁珠沉淀。

用1毫升生产商推荐的1×结合与洗涤缓冲液重悬磁珠沉淀，混匀，然后将离心管置于旋转器上，室温孵育5分钟，洗涤一次。随后用缓冲液A和缓冲液B各洗涤两次。孵育结束后，弃去上清液，保留磁珠沉淀。

接下来，将珠粒沉淀重悬于 300 微升 2 倍洗涤与结合缓冲液中。将珠粒等分为三份，每份 100 微升，分别加入三个 1.5 毫升离心管中。每管中加入 100 微升无 RNase 水、100 微升生物素标记的萤火虫荧光素酶 RNA 以及 100 微升生物素标记的 AR 3'非翻译区 RNA。

将每种磁珠混合物在室温下旋转孵育一小时。然后将离心管置于磁力架上静置一分钟，移除并弃去上清液。

保留珠粒沉淀。接下来，用1X洗涤与结合缓冲液将珠粒沉淀重悬，每次400 µL，洗涤两次；每次重悬后，于室温下在旋转仪上孵育5分钟。将离心管置于磁力架上静置1分钟。

然后，移除并弃去所有上清液。将每份珠粒沉淀重悬于 50 µL 核分离缓冲液中。为准备后续步骤，请确保所有缓冲液以及玻璃匀浆器（Dounce 匀浆器）均已预冷并置于冰上。

细胞裂解液的制备应在冰上进行。对于每项将要进行的RNA下拉实验，准备来自三周龄C57 Black Six野生型小鼠的一盘15厘米培养皿中已分化的前脂肪细胞。四到五天后，为收集细胞，加入10至15毫升PBF，然后使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。

将它们转移至一个50毫升离心管中，然后在室温下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。离心后，用1毫升移液器吸出并弃去上清液。随后，将细胞沉淀重悬于2毫升低渗缓冲液中，并将细胞置于冰上孵育15分钟。

将细胞转移至15毫升Dounce玻璃匀浆器中，在冰上用20次抽吸进行机械剪切。在4摄氏度下以3300 × g离心15分钟，沉淀细胞核。离心后，将上清液转移至1.5毫升离心管中，将沉淀物置于冰上以备后续使用。

向上清液中加入 3 摩尔的氯化钾，使终浓度达到 150 毫摩尔。在 4 摄氏度下以 20,000 ×g 离心 15 分钟。离心后，顶部会出现一层脂质层。

使用1 mL移液器小心吸除上清。然后，收集细胞质裂解物上清液。接着，用1 mL移液器将核沉淀重悬于1 mL核分离缓冲液中，并转移至15 mL Dounce玻璃匀浆器中。

在冰上用100次剪切作用对细胞核进行机械剪切。在4°C条件下，以20,000 × g离心15分钟，沉淀细胞核碎片。收集上清液作为细胞核裂解物。

这些组分可与先前收集的细胞质裂解液混合，也可保持分离以用于后续实验。此处，样品按1:1的比例混合。向未分级的细胞裂解液中加入RNase抑制剂，使其终浓度达到每微升0.5单位。

然后，将100微升细胞裂解液置于冰上保存，作为蛋白质印迹分析的输入对照。将细胞裂解液均分为三份，每份1毫升，分别加入1.5毫升离心管中，并分别与空白萤光素酶RNA偶联磁珠及AR 3′非翻译区（3′UTR）偶联磁珠在4°C条件下旋转孵育3小时。孵育结束后，将离心管置于磁力架上静置1分钟。

使用1毫升移液器收集上清液，然后按照随附文件中所述的方法分离RNA并评估RNA的完整性。将磁珠沉淀物置于冰上。洗涤磁珠六次。

每次将珠粒沉淀重悬于 1 毫升含有 40 单位 RNase 抑制剂和 0.25% igepal 的细胞核分离缓冲液中。室温下旋转孵育 2 分钟。将离心管置于磁力架上，分离磁珠与上清液。

一分钟后，吸出并弃去上清液，将磁珠沉淀置于冰上。为从磁珠中洗脱RNA-蛋白质复合物用于蛋白质印迹分析，首先，将每份磁珠沉淀重悬于75 µL核分离缓冲液中。然后，加入25 µL 4X蛋白质印迹上样缓冲液。

加入SDS，使总体积达到100微升。最后，将珠子在此100微升溶液中于95摄氏度煮沸5分钟。按照随附文件所述进行Western印迹，以验证RBP。

在本实验中，使用抗原受体RNA片段作为诱饵来捕获其结合蛋白HuR。与HuR蛋白无关的萤光素酶RNA诱饵以及一份未偶联的空白链霉亲和素磁珠作为阴性对照。RNA与蛋白质的相互作用可能发生在细胞核或细胞质中，该拉下实验方案可应用于全细胞裂解液，或经分离的细胞核或细胞质裂解液。

通过蛋白质印迹分析，使用单克隆抗体在未分级的细胞裂解液（即上样样品）中检测到HuR蛋白。抗原受体RNA洗脱组分也呈阳性结果，表明在使用抗原受体RNA偶联磁珠进行RNA下拉实验时，脂肪细胞裂解液中存在HuR蛋白。而萤光素酶RNA洗脱组分和空白磁珠样品均呈阴性结果，表明采用该方法无法检测到非特异性相互作用。

综上所述，这些结果表明抗原受体RNA片段与HuR蛋白之间的相互作用具有特异性。观看本视频后，您应能够充分理解如何从棕色脂肪组织的RNA转录本中回收RNA结合蛋白。一旦掌握该技术，若操作得当，可在24小时内完成整个流程。