如何研究基底膜硬度作为前列腺癌及其他年龄相关病理或代谢性疾病的生物物理触发因素

该模型的总体目标是研究由于晚期糖基化终末产物暴露导致的基底膜硬度和厚度变化，如何调节侵袭性细胞行为，从而对应于转移性前列腺癌的早期和晚期阶段。该方法有助于回答与年龄相关疾病领域中的关键科学问题，例如基底膜硬度和厚度的增加如何促进癌症进展，以及糖尿病等代谢性疾病的发生机制。

该技术的主要优势在于，它提供了一种简单的方法，可在临床环境中模拟在人类前列腺肿瘤中测得的刚度水平。该技术的意义在于，通过加深我们对基底膜刚度如何促进分子和细胞变化的理解，从而拓展了前列腺癌的治疗与诊断。由于该模型具有多学科交叉的特点，初学者在使用该方法时可能会遇到困难。

结合化学、物理学和生物学领域的技术。我们最初提出该方法的设想，是基于以下假设：前列腺中基底膜的刚度可能促进已知转化的上皮细胞产生新的侵袭行为。该方法的视频演示至关重要，因为跨学科的操作步骤需要进行详细描述。

包括基底膜的交联，随后进行三维细胞培养。首先准备一个平整的冰面，并用其将八孔玻璃培养板冷却至4°C。然后，剪掉200微升移液器吸头的末端，并将吸头同样冷却至4°C。

冷却后，将枪头装到一支容量为 200 微升的移液器上，吸取 40 微升冰上预冷的 BM 基质溶液，加入预冷的八孔玻璃培养板的每个孔中。然后将培养板置于 37 摄氏度环境中 30 分钟，以促进基底膜的聚合。

非常小心地关闭培养箱门，以避免扰动液体状态的重建基底膜。精确孵育30分钟后，加入250微升预先配制的乙醇醛溶液，以覆盖已聚合的重建基底膜。接下来，通过向天然的重建基底膜凝胶中加入250微升无菌PDS，制备阴性对照。

此外，在将乙醇醛溶液加入基底膜凝胶之前，通过分别添加50毫摩尔的氰基硼氢化钠或250毫摩尔的氨基胍，制备另外两个对照组。然后在37°C下孵育凝胶6小时，以形成半硬凝胶；或孵育14小时，以形成硬凝胶。

孵育结束后，小心移除凝胶中的溶液，并向每块凝胶中加入250 µL的1 M甘氨酸乙酯。在37°C下继续孵育1小时。用500 µL PBS将每块凝胶洗涤10次，以彻底去除乙二醛溶液和甘氨酸乙酯的残留。

然后加入 400 µL PBS 以防止脱水，并将重建的基底膜凝胶在 37°C 下孵育过夜。准备继续操作时，移除重建基底膜凝胶中的 PBS，每孔加入 250 µL 冰冷的双蒸水。将凝胶在 4°C 下孵育 16 至 24 小时，以确保基质完全液化。

然后将液化的基底膜转移至一个1.5毫升离心管中，并使用分光光度计测定溶液的荧光发射。接着离心溶液并弃去上清液。将沉淀物重悬于500微升含有20毫克/毫升溴化氰和70%甲酸的溶液中。

将样品在室温下孵育过夜。接着，使用一个1毫升的一次性注射器将重新悬浮的基底膜凝胶转移至截留分子量为3.5千道尔顿的透析盒中。将该透析盒浸入盛有500毫升双蒸水的500毫升玻璃烧杯中。

使用磁力搅拌子搅拌溶液。将该装置在4°C条件下放置过夜，以彻底去除氰基溴和甲酸。使用1毫升一次性注射器将透析后的溶液从透析盒转移至1.5毫升离心管中。

然后将溶液在12%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析。用银染法染色凝胶，以观察溴化氰裂解基质肽的电泳图谱。从覆盖有PBS的基底膜凝胶开始，用含有0.1毫摩尔氯化钙的300微升PBS再冲洗凝胶两次。

加入0.5毫摩尔的氯化镁，在室温下孵育5分钟。然后，移除PBS，并加入300微升4%多聚甲醛，以覆盖每一块重建的基底膜凝胶。

将凝胶在室温下孵育30分钟，以固定重组的基底膜组分。接着，去除固定液，加入300微升含有75毫摩尔氯化铵和0.5毫摩尔氯化镁的封闭溶液。在室温下孵育5分钟后，移除溶液，并重复洗涤四次。

最后一次漂洗后，向重建的基底膜凝胶中加入 300 微升免疫荧光缓冲液，以防止非特异性反应。将凝胶置于摇床平台上，室温孵育 2 小时。然后移除免疫荧光封闭缓冲液。

加入300 µL用封闭缓冲液稀释的一抗。将重建的基底膜凝胶在4°C孵育16小时。次日，移除一抗，并用300 µL免疫荧光缓冲液将凝胶洗涤3次。

每次加入缓冲液后，在摇床平台上室温震荡10分钟。然后吸去缓冲液，加入300微升用封闭缓冲液稀释的荧光标记二抗。将样品置于摇床平台上，室温孵育2小时。

去除二抗。用免疫荧光缓冲液冲洗样品，随后用 PBS 冲洗，然后再次固定并淬灭样品。最后封片凝胶，并使用显微镜分析致密束的形成。

为形成前列腺腺体腺泡，将5,000个RWPE-1细胞重悬于300微升完全KSFM培养基中，并添加2%基底膜溶液。为形成前列腺肿瘤细胞聚集体，将2,500个PC3细胞重悬于300微升RPMI-1640培养基中，并添加2%基底膜溶液。在PBS中对重建的基底膜凝胶进行过夜孵育后，用500微升培养基洗涤两次。

在接种细胞之前，将细胞轻轻接种到天然的以及晚期糖基化终末产物增韧的重建基底膜上，并小心地将培养物放入培养箱中，以确保腺泡和球状体均匀生长分布。

对于形成腺泡的细胞，每两天更换一次新鲜培养基，培养基中需含有2%的基底膜溶液，以确保细胞获得维持正常腺泡稳态所需的生长因子。培养六天后，前列腺上皮细胞可在天然重建的基底膜上形成腺泡结构。

并形成上皮细胞的均一球状结构。这些腺泡还具有高度有序的极性上皮细胞（PECs）特征，表现为从顶端到基底的极性以及可见的管腔空间。当在硬化膜上培养六天后，细胞的结构出现紊乱。

并从球形变为多边形形状。此外，这些腺泡高度紊乱，失去了顶端到基底的极性，腔隙空间很小或几乎不存在。

良性前列腺增生的前列腺组织来源的细胞也表现出类似现象。当测量前列腺肿瘤细胞时，发现其在较硬的重建基底膜上长度更长，迁移速度更快，且细胞迁移的持续性增强。观看本视频后，您应能充分理解如何建立模型以研究基底膜硬度对上皮细胞和肿瘤细胞行为的影响。

在进行该操作时，重要的是要记住，需诱导出理想的基底膜硬度，并确保单个腺泡或s-球状体正确形成。该技术建立后，为肿瘤学领域的研究人员探索前列腺中基底膜硬度诱导癌细胞侵袭的机制铺平了道路。在遵循本方案的基础上，还可开展其他方法，例如对细胞裂解液进行免疫印迹分析，以进一步研究受基底膜硬度调控的信号通路相关问题。

请注意，使用氰基硼氢化钠、溴化氰和甲酸具有极高的危险性，进行本实验操作时，必须在通风橱中进行，并始终采取防护措施，例如穿戴实验服、手套、面罩和呼吸器。