质谱流式细胞术分析的样本制备

本样品制备流程的总体目标是实现对多种样品进行稳定且可重复的抗体染色，从而能够分析异质性细胞群体。该方法可用于解答关于复杂异质性细胞群体中细胞身份、细胞信号传导及细胞应答的问题。该技术的主要优势在于，能够在单细胞水平上检测高参数的蛋白质表达水平。

本实验操作将由本实验室的研究生 Aundrietta Duncan 演示。对于每份单细胞悬液样品，用无血清培养基重悬至浓度为每毫升四乘以十的六次方个细胞，每 2/10 的六细胞样品中加入 500 微升新配制的 50 微摩尔顺铂，并将样品置于旋转摇床上，在室温下持续振荡孵育。一分钟后，加入等体积的洗涤缓冲液淬灭顺铂反应，随后离心细胞。

弃去上清液，再用 500 微升洗涤缓冲液洗涤样品两次，每次均通过离心细胞并倾倒弃去洗涤缓冲液。随后同样用 500 微升 PBS 洗涤两次，每次均离心样品并弃去上清液。第二次 PBS 洗涤后，将沉淀重悬于 500 微升新鲜 PBS 中，并加入 500 微升 4% PFA 固定细胞。

用移液器吹打细胞以混匀。随后将样品置于摇床中，在室温下持续振荡混合15分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞沉淀，弃去上清液，再用新鲜的PBS洗涤一次。

为了透化细胞，再次离心细胞并弃去上清液。用残留的 PBS 轻柔涡旋重悬样品，并立即通过轻柔吹打加入一毫升 100% 甲醇至 2/10 × 10⁶ 个细胞中。将样品在 4°C 下孵育至少一小时，孵育结束后离心细胞。

随后，倒出甲醇。然后每毫升甲醇用一毫升洗涤缓冲液洗涤沉淀，再用500微升新鲜洗涤缓冲液重复洗涤两次。使用调至50微升的200微升移液器，将每个沉淀中残留的洗涤缓冲液转移至相应抗体混合液的离心管中。

将移液器吸头插入合并后的溶液中，保持按钮部分下压，避免吸入空气，重新吸取溶液。然后将移液器吸头转移至含有500 µL洗涤缓冲液的1.5 mL微量离心管中，在此过程中不要松开按钮。松开按钮，吸入洗涤缓冲液，使抗体混合液总体积达到50 µL，并通过轻柔移液将吸出的抗体混合液加入相应的待标记样品中。

在室温下持续振荡孵育一小时后，将样品洗涤四次，每次均倾去洗涤缓冲液。为了用铱对细胞进行标记，将最终的沉淀重悬于500 µL PBS中，随后加入500 µL 4%多聚甲醛，在室温下孵育15分钟。接着，向样品中加入500 µL新配制的62.5 nmol/L铱和多聚甲醛溶液，在室温下继续振荡15分钟。

然后，离心细胞，弃去上清液，并用500微升含0.1% BSA的过滤去离子水洗涤两次。通过将标准化微珠加入样品板的孔中，用移液器将细胞加入这些孔内，然后在24小时内进行质谱流式细胞术分析。在完成信号强度标准化后，可通过门控排除含铱-191阳性的微珠阴性细胞群，从而从数据中去除校准微珠信号。

然后可以通过使用铱193阴性表达与事件长度的双轴图对单细胞事件进行设门，以去除碎片和细胞多重体。顺铂标记可用于测量细胞的深度。例如，此处展示了死细胞数量较低和较高的样本。

可通过排除铂-198阳性的细胞群体来去除死细胞，条形码标记可使各样本在条形码参数中实现明显分离，从而将细胞分配至其原始样本身份。IDU标记可用于检测此处观察到的US面细胞。在完成初始归一化、去条形码及设门步骤后，可利用SPADE算法对高维数据进行分析，以生成更易于可视化解释的低维数据表示。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在四到六小时内完成。在进行此实验步骤时，重要的是要记住在洗涤步骤中尽量减少样品损失。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备用于质谱流式细胞分析的样品。

请注意，叠氮化钠具有潜在危险性，因此在进行此操作时应采取预防措施，例如穿戴适当的个人防护装备（PPE）。