在液体中利用振幅调制原子力显微镜实现亚纳米级分辨率成像

本实验的总体目标是利用商品化的原子力显微镜（AFM）在液体环境中进行振幅调制模式（也称为轻敲模式）操作，以实现尽可能高的成像分辨率。该方法通过优化各项参数组合来获得高分辨率，从而突破标准AFM在液体中操作的性能极限。该技术的主要优势在于适用于大多数商品化的AFM设备，因此无需任何专用设备。

本文所述方法面向已具备原子力显微镜（AFM）基本知识，但希望更充分地利用该技术的科研人员和技术人员。该方法不针对任何特定类型的样品，可广泛应用于物理学、生物学、化学、材料科学及表面科学领域的样品。通常，刚接触该技术的人员可能会遇到困难，因为针对特定样品寻找最佳参数需要一定的耐心。

将仪器及支撑基底的圆盘在超纯水中进行超声波清洗，随后用异丙醇清洗，再用超纯水清洗，每次清洗均为10分钟。当追求高分辨率时，任何污染都可能产生不利影响。

始终佩戴手套，并确保任何接触样品、悬臂或原子力显微镜（AFM）样品池的表面或仪器均已彻底清洁。超声处理后，在氮气流下干燥所有仪器及样品圆盘。使用钢制圆盘作为云母的支撑基底，以实现单个吸附金属离子的成像。

对于无法通过超声清洗的表面，依次使用浸有超纯水、异丙醇和超纯水的单层低尘擦拭纸进行擦拭，以实现物理清洁。让表面在空气中干燥最多30分钟。接着，通过充分混合试剂制备少量环氧树脂胶，并将约10微升环氧树脂滴加到洁净的钢制样品圆盘上。

将云母基底置于环氧树脂上，通过施加压力将其固定在钢盘上。根据制造商的说明，在升高的温度下使环氧树脂固化数小时。然后，将一块2.5厘米宽的胶带牢固地按压在基底表面，确保完全覆盖整个表面，再平稳地剥离顶层。

重复此过程两到三次，直至云母表面在肉眼下呈现镜面般光滑。将悬臂梁芯片先后浸入异丙醇和超纯水中，每次各60分钟。随后，将探针暴露于紫外光下最多五分钟，以促进稳定水合位点的形成。

过长的曝光时间可能会损坏针尖，或增大其曲率半径。将悬臂插入原子力显微镜的悬臂夹持器中，并用移液器吸取25 µL成像液体滴加到悬臂和针尖上，以预先润湿表面。这将在接近样品时减少气泡的产生。

将样品圆盘和基底熔接到样品台上，并在样品上加入一滴成像液体。然后将悬臂梁支架连接到原子力显微镜（AFM）。使悬臂梁与样品靠近，以便在悬臂梁尖端的液体与样品上的液体之间形成毛细桥。

使用原子力显微镜（AFM）软件将测量激光对准悬臂末端的针尖附近。接着，从悬臂的热谱图中的主峰确定其共振频率。若已对悬臂的偏转进行校准，则通过简谐振子模型对共振峰进行拟合，可得到悬臂的弹性常数。

然后，通过在接近热谱中确定的共振频率的范围内施加外部驱动，找到悬臂的振幅响应，从而调节悬臂。调节驱动振幅，使自由振荡振幅约为五纳米。在大多数原子力显微镜上，这通常对应0.2–0.8伏。

然后，将振幅设定点调整至自由振幅的约80%。接下来，将反馈增益设为相对较高的值。在确保无任何不稳定或振铃现象发生后，将初始扫描速率设为约1赫兹，扫描尺寸设为10纳米。

使用原子力显微镜（AFM）控制软件使探针开始接近样品表面。通过轻微调整设定值，判断探针是否已到达表面但尚未开始成像。如果探针已到达表面，则对ZPA区域延伸范围的影响应可忽略不计。

当探针尖端到达表面后，收回ZPA区域并重新调节悬臂梁。由于探针与样品之间的相互作用，共振频率可能会降低。此时，将设定点调整至新调谐自由振幅的大约80%，然后使悬臂梁接触样品，以振幅调制模式对表面进行10 × 10 纳米的扫描，以确认成像参数是否合适。

检查正向扫描与反向扫描曲线是否重合。若不重合，则进一步降低设定点，并尝试提高增益。若图像变得嘈杂，则降低增益。

如果条件允许，可对样品上较大区域（1至5平方微米）重复进行该操作。对于较软或生物样品，此操作可能导致针尖污染。此时应减小扫描尺寸，以适合观察目标特征的大小为宜。

这可以低至20乘以20纳米。接下来，将悬臂的驱动振幅降低到足以使反馈回路自动收回ZPA区域，使探针尖端脱离表面。当悬臂远离表面时，调节驱动振幅，使悬臂的振幅为峰峰值1至2纳米。

逐步小幅降低设定点，直至ZPA区域再次向表面延伸并恢复原始图像。将设定点振幅保持在新的自由振幅的75%至95%之间。随后重新调整增益，因为在较低振幅下可使用较高的增益而不会引入显著噪声。

优化系统以找到自由振幅、设定点和增益的最佳组合，从而实现高分辨率。最佳系统条件取决于样品、液体的润湿特性以及所使用的悬臂梁。对于亲液性界面，应使用弹簧常数为 0.5 至 2 牛顿每米的悬臂梁。

利用该技术，已在多种样品上获得了亚纳米分辨率的图像。此处展示的软性样品包括脂质双层、盐杆菌（Halobacterium salinarum）的紫色膜、两亲性双分子自组装单层膜，以及牛晶状体膜中水通道蛋白的晶体。在每种情况下，感兴趣的结构特征均被突出显示。

微小的振荡幅度和较高的设定值可最大限度地减少探针对样品施加的力，从而能够在溶液中对双分子层中的脂质、天然生物膜中的蛋白质以及两亲性分子等脆弱的自组装结构进行成像而不造成损伤。这种方法也可用于成像较硬的结晶材料，例如方解石、钛酸锶、碳化硅以及吸附在云母表面的单个金属离子，因为在所有这些情况下，实际成像的是界面液体，而非晶体本身。一旦掌握，该技术在液体环境中几乎每次正确操作时都能实现分子或原子级别的分辨率。

在进行该操作时，必须牢记所成像的是界面液体，这意味着需要采用柔和的成像条件。探针、样品或液体的污染通常是导致无法获得高分辨率图像的主要原因。

如有任何疑问，通常最好清洁所有与液体接触的表面，并重新使用成像溶液。外部噪声也会对高分辨率产生不利影响。应选择远离通风管道的低振动地面。

观看本视频后，您应能充分理解如何优化成像参数以实现高分辨率的原子力显微镜（AFM）成像。当然，与任何前沿技术一样，可能需要多次尝试才能确定最佳的样品成像方法，因此耐心至关重要。