一种基于快速滤插件的三维培养系统用于原代前列腺细胞分化

该基于滤膜插件的3D培养系统用于患者来源的原代细胞，其总体目标是建立一种更符合生物学实际的体外模型系统，以用于前列腺癌研究。通过使用人原代细胞，该方法有助于回答前列腺发育生物学以及前列腺癌研究中的关键问题。该技术的主要优势在于，它是一种相对快速的体外方法，可用于建立已分化的原代前列腺细胞，同时还能快速分离RNA、DNA和蛋白质等生物分子。

这些方法的可视化演示至关重要，因为用于组织学或RNA和蛋白质收集的滤膜插件上的细胞处理过程较为精细且对时间敏感。为帮助限制生物安全柜中各腔室之间的扩散，在插件底部涂上一层0.1%明胶，并使其干燥。重复此步骤两次。

然后将细胞接种至明胶包被的插入式培养小室的内室中，并培养最多两周。两周后，将培养好的滤膜插入式小室直接用于下述详述的适当下游实验之一。开始该操作时，吸除外室中的 PBS，并小心移除内室中的 PBS。

培养小室可在 PBS 中短时间保存，直至开始操作，但切勿让膜干燥。接着向每个内室加入 100 微升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。然后在 37 摄氏度下孵育五分钟。

随后，用200微升移液器在膜表面轻轻反复吹打，短暂而小心地刮取细胞。然后在37摄氏度下孵育1分钟。1分钟后，向第一个内室加入250微升条件培养基，并轻轻吹打上下混合，以冲洗滤膜。

完成转移后，将重悬的细胞移至相邻的滤膜室中，该滤膜室含有相同的培养基条件，并重复吹打混匀。对同一条件下的每个插入式培养小室均重复此操作。随后收集细胞，并将其转移至1.5毫升离心管中。

用额外的 100 至 200 微升培养基冲洗每个内室，以收集残留的细胞，并将其加入 1.5 毫升离心管中。随后在 4°C 下，将细胞以微量离心机离心 5 分钟。之后吸除上清液，并用 1,000 微升 PBS 重悬洗涤细胞沉淀一次。

将细胞在4°C下以微量离心机离心5分钟。5分钟后吸除PBS，并将样品在-80°C下冷冻，以备后续使用。在此步骤中，向内室加入200 µL硫氰酸胍-苯酚-氯仿或类似的提取试剂，并通过上下吹打轻轻振荡膜表面的细胞。

然后将细胞在提取试剂中于室温孵育5分钟，并保持外室干燥。随后通过反复吹打提取液清洗滤膜。通过倾斜六孔板并吸除残留液体，尽可能收集全部提取试剂。

请注意，滤膜可能会从插入物上解离。如果发生附着，请清洗解离的滤膜。然后尽可能收集提取试剂，并按照制造商的说明书进行DNA、RNA或蛋白质的纯化与回收。

使用硫氰酸胍洗涤细胞和滤膜时应小心操作，因为过度振荡可能导致RNA质量下降。为了从滤膜插入物中分离蛋白质，需将滤膜插入物置于冰上的六孔板中，然后向内室加入10 µL蛋白质裂解缓冲液。

使用20微升移液枪在膜表面反复吹打，同时搅动并刮下细胞，注意避免在裂解缓冲液中产生气泡。随后将含有滤插膜的六孔板置于冰上孵育10分钟。重复刮取操作，然后用裂解缓冲液冲洗膜表面。

从六个插入物中收集裂解液，并将其转移至冰上的1.5毫升离心管中。接着，用额外的10微升裂解缓冲液冲洗第一层膜，并将其转移至下一个滤器。对同一实验条件下的所有插入物重复此操作，收集残留的裂解缓冲液并加入1.5毫升离心管中。

将样品在冰上额外孵育五分钟。然后在四摄氏度下以最大速度离心15分钟。完成后，用移液器将裂解液转移至新的1.5毫米离心管中。

然后进行蛋白质浓度分析，或将裂解液在-80摄氏度保存。在此步骤中，分别向内室和外室加入500微升和1毫升的10% NBF。在4摄氏度下孵育过夜。

第二天，吸出外室中的NBF，并向一个1.5毫升离心管中加入一毫升HEA处理凝胶。使用微波炉以低功率、多次10秒脉冲的方式缓慢融化琼脂糖，直至完全熔化。将HEA置于37摄氏度温浴中保温，防止凝固，待用时取出。

接下来，从内室中移除NBF。向内室中加入25 µL熔化的HEA，并让琼脂糖凝固2至5分钟。然后将两块泡沫组织学垫用10% NBF浸湿，并将其中一块放入包埋盒中。

使用HistoGel保护滤膜插件上细胞层的完整性，是保存完整细胞层以进行组织学切片的关键步骤。随后，使用11号刀片从塑料插件室的底面划开滤膜，使其部分松解。在培养皿中加入100–200微升NBF，并将部分脱离的滤膜浸入NBF中。

使用10号刀片手术刀，从插入室内部轻轻按压滤膜的中部，以将滤膜完全从插入管筒中分离。如果滤膜仍有部分与管筒相连，用手术刀将其切断。随后将涂有HEA的滤膜切成两半。

将滤膜的每一半放置在已准备好的组织学盒中的泡沫垫上。然后向盒中加入第二块经10%NBF浸泡的海绵，使滤膜被夹在中间。最后扣紧盒盖，密封组织学盒。

将其置于NBF中，4°C过夜孵育。该明场图像显示了多孔膜上方的多层细胞层。分别展示了细胞核、P63和雄激素受体的单个荧光图像，以及三种荧光标记的叠加图像。

最后显示的是明场与免疫荧光信号的复合叠加图像，用以确定荧光信号相对于细胞和滤膜的位置。此处展示了滤膜插入物的横截面图像，并与完整前列腺的导管上皮层进行了比较。一旦掌握该技术，可在两周内完成全部操作，若操作得当，最终的细胞与滤膜插入物或目标生物分子的分离过程可在30分钟内完成。

在进行此操作时，重要的是始终注意在使用滤膜小室时保持谨慎，以避免对细胞层或下方的滤膜造成损伤。完成此操作后，可进一步采用其他方法，如蛋白质印迹（Western blot）、RNA 微阵列和蛋白质组学分析，以回答与信号通路分析和癌细胞相关的更多科学问题。该技术将为前列腺癌领域的研究人员提供支持，有助于利用原代前列腺细胞更深入地探索前列腺生物学特性以及前列腺癌的发病机制。

观看本视频后，您应能充分掌握如何正确设置并从此三维培养系统中回收培养的原代前列腺细胞。