用于免疫分析的三维纸质微流控装置的制备

本方案的总体目标是展示我们用于制备三维纸质器件的流程，这些器件被用作开发即时检测免疫分析方法的平台。该方法提供了一种基于纸张的微流控平台，并具备可靠的制造工艺，从而可将时间和精力集中于分析方法的开发，而非器件设计。本技术的主要优势在于，能够并行制备大量器件，满足学术研究项目所需的数量要求。

通常情况下，新用户在使用该方法时会遇到困难，因为在制备器件时需要考虑许多变量，例如各层之间的正确对齐。操作失误可能导致器件功能异常。对该方法进行可视化演示至关重要，因为仅依靠论文中提供的文字细节，很难准确想象出组装过程的具体操作。

首先，将一整张定性滤纸裁剪成标准纸张尺寸，以方便使用蜡质打印机进行图案化处理。将裁好的滤纸放入打印机进纸盒中，然后打印预先设计好的图层。

接下来，使用台式纸张裁切机将尼龙膜原膜裁切成片状，操作时需格外小心，以保持尼龙膜的完整性并防止撕裂。未使用的尼龙膜应储存于干燥柜中，因为尼龙膜对湿气敏感。使用蜡质打印机将捕获层图案打印到一张复印纸上，并用胶带将其固定在光源箱上，作为尼龙膜定位的参考指南。

随后，将一张干净的复印纸覆盖在先前已打印的复印纸上。用胶带将干净的复印纸固定在光源箱上，但不要将两张复印纸粘在一起。接着，将裁剪好的尼龙膜放置在干净的复印纸上，确保膜完全覆盖下层复印纸的打印区域。

将尼龙膜的四边全部用胶带固定在一张干净的复印纸上。将带有尼龙膜并已粘贴在复印纸上的纸张装入手动进纸打印机托盘中。然后每次打印一张尼龙膜。

将打印好的纸层粘贴到亚克力框架上，以便在重力对流烘箱中加热时，纸层上下两面受热均匀。接着，将纸层放入烘箱中，在150摄氏度下加热30秒，直至石蜡熔化并渗透至纸张厚度方向。从烘箱中取出纸张后，将其翻转，检查设计是否存在缺陷，以确认石蜡已完全渗透纸张厚度。

从丙烯酸框架上取下纸张和尼龙膜。然后使用切纸机将尼龙膜从复印纸的支撑纸上分离。使用机器人刀片绘图仪，根据预先准备好的设计文件对双面自粘膜进行裁切成型。

随后，将需要背胶的图案纸张（印刷面朝下）用胶带固定在光源箱上。从图案胶片的一侧揭去保护衬纸。将胶片与纸张层压在一起。

然后将部分组装好的装置放入保护套中。接着，将形成的双层组件通过自动覆膜机，彻底压合粘合剂和纸张，去除各粘合层之间可能存在的任何气袋。将结合层用胶带固定在丙烯酸框架上，使待处理的亲水区域处于悬空状态，不与框架接触。

在结合垫的亲水区域加入 2.5 µL BSA 和一倍浓度的 PBS。室温下静置干燥 2 分钟后，于 65 °C 干燥 5 分钟。随后，加入 5 µL 浓度为 5 OD 的胶体金纳米颗粒-抗 β-hCG 抗体结合物，然后重复干燥步骤。

将侧向通道层粘贴到丙烯酸框架上，使待处理的亲水区域悬空，且不与框架接触。加入10微升封闭剂以处理侧向通道，然后重复使用与结合层相同的干燥过程。接着，将捕获层粘贴到丙烯酸框架上，使待处理的亲水区域悬空，且不与框架接触。

用5 µL抗-α-hCG抗体处理捕获层。室温下静置2分钟使样本干燥后，在65 °C下干燥8分钟。加入2 µL封闭剂，然后重复与捕获层相同的干燥步骤。

将清洗层用胶带固定在光源箱上，印刷面朝上。如果使用了对齐孔，请使用手持打孔工具从后续各层中移除这些孔。撕去捕获层背面的保护膜，以暴露粘合剂。

使用对齐孔作为参考，将捕获层置于洗涤层上方，然后将两层压合在一起，避免触碰亲水区域，以尽量减少污染或对装置造成损坏。随后，移除孵育层背面的保护膜以暴露粘合剂。将孵育层对准捕获层上方，并将其压合在一起。

以这种方式继续添加各层，直至所有活性层均组装完毕。现在，将部分组装好的装置放入保护套中，并使用覆膜机将各层牢固地压合在一起。撕去洗涤层背面的保护膜，并将印迹层贴附在装置底部。

完成三维纸基微流控装置的压膜组装后，使用剪刀从完全组装好的装置片材上裁下所需数量的装置。向装置顶部的亲水区域加入 20 微升 hCG 缓冲液阳性对照样品。待样品完全通过芯吸作用进入装置后，加入 15 微升洗涤缓冲液。

当第一份洗涤缓冲液完全渗入装置后，加入第二份15微升的洗涤缓冲液。为显示检测结果，使用镊子剥离装置的上层三层材料，暴露捕获层。蜡印法可用于在基于纸张的微流控装置中形成疏水屏障，并产生尺寸可重复的流体通道，这对于实现检测结果的可重复性以及反应时间的一致性至关重要。

通过平行进行35次阳性检测和35次阴性检测，验证了基于纸张的hCG免疫测定法的性能。使用阴性样本进行检测时，每组数据的变异系数为1%；使用阳性样本时，变异系数为3%。孵育通道和捕获区所包含各层之间的错位可能导致阳性信号出现不规则图案，进而引起对定性信号的误判。

如果蜡未被充分打印或未完全熔融穿透纸张的整个厚度，则所形成的疏水屏障完整性可能受损，导致装置内发生泄漏。若检测所需时间超过预期，可能表明装置在制备过程中存在故障。基于纸张的微流控装置为研究人员提供了一个多功能平台，可用于开发低成本、适用于即时检测的分析方法。

尽管存在多种应用，但我们在此演示的方法能够构建一种通用的设备结构，用于进行免疫测定，而免疫测定在医疗保健中至关重要。在实施该过程时，必须注意在制造过程中以及在使用昂贵的生物化学试剂处理各层之前，检查是否存在缺陷。一旦掌握，该方法从打印各层到组装经处理的层，可在两小时内完成一张功能性免疫测定芯片的制备。

观看本视频后，您应能充分理解如何制备三维纸质微流控装置，并能够自如地将该平台改造用于其他感兴趣的检测类型。