使用连续流动微点样仪在修饰表面上进行细胞的浸没式打印

本实验的总体目标是将三T三成纤维细胞打印到经血清包被的表面。首先，将血清预先吸附到组织培养表面；第二步，使用连续流动微点样仪将成纤维细胞悬液打印到该表面，随后将细胞在37摄氏度下孵育两小时。

接下来，将打印的细胞以及通过标准细胞培养接种的细胞用碘化丙啶染色，并在倒置显微镜下进行观察比较。最终，通过荧光显微镜在相应时间点评估细胞的活力、密度和形态。该技术相较于现有方法（如针式打印）的主要优势在于，打印头可在表面形成密封，使细胞能够在细胞培养基中浸没状态下完成打印。

尽管细胞的浸没式打印在筛选新药候选物的安全性和有效性方面具有实用价值，但浸没式打印技术总体上还可用于其他多种应用。例如，我们可以利用该技术针对组织切片分析新药候选物，或将其作为器官系统的模型，如肝脏灌注模型。

通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为在打印机引液和细胞打印过程中，空气不能进入管路，否则可能导致细胞死亡。首先，在37摄氏度的摇动水浴中解冻NIH 3T3细胞两到三分钟。用5毫升完全培养基重悬细胞，并在1500 ×g 下离心3分钟。

小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀。然后用5 mL培养基重悬细胞，并将10 μL细胞悬液转移至0.5 mL微量离心管中。接着，向细胞悬液中加入10 μL台盼蓝染液，用移液枪头轻轻混匀，再吸取10 μL染色后的细胞悬液加入血细胞计数板的计数室中。

在10倍放大倍数下计数细胞前，先计数四个大方格中呈小白色球状的活细胞。仅计数未被台盼蓝染色呈现深蓝色的活细胞。计算每个大方格中的平均细胞数量，由此得出原始细胞悬液中每毫升细胞数量乘以10,000的结果。

然后以每毫升100,000个细胞的密度接种细胞，每个T25培养瓶中加入总共5毫升细胞悬液。在开始实验前，将细胞培养至70%至80%融合度。为准备打印表面，使用记号笔在经组织培养处理的聚苯乙烯12孔板底部标记出与打印头大小相同的矩形区域。

用移液器将50微升胎牛血清加入矩形区域，并使其覆盖整个区域。用移液枪头将培养板置于无菌生物安全柜中过夜，使血清斑点完全干燥。开始水下打印前，用蒸馏水冲洗打印头。

然后，用蒸馏水填充一个60毫米的培养皿，并将打印头停靠在水面上，使用气动泵以每分钟150 µL的流速让蒸馏水通过各通道，持续两分钟。随后倒掉培养皿中的水，并重新加入洁净的水。接着，将打印头在水中上下移动三次。

将打印头中心对准预先准备好的12孔板中涂有血清的位点。然后用预热的完全培养基对打印头进行引液，每通道300微升。

若进行多次打印，在每次打印之间除水洗外，还需增加一次漂白剂冲洗。随后将悬浮细胞以每毫升50,000个细胞的浓度打印到表面，打印速率为每分钟60微升，每通道100微升。

细胞打印完成后，将打印头左侧停靠在表面，并将管路装置放入细胞培养孵育箱中。设置条件为5%二氧化碳、37摄氏度，孵育两小时。两小时孵育结束后，移除打印头，并将盖子盖在培养皿上。

移除打印头的时间被视为零小时时间点。作为对照，同时进行标准细胞培养。向其中一个含血清点样的12孔板中加入1毫升预热培养基，然后取1毫升剩余的细胞悬液，用移液器将其加入12孔板的单个孔中。

这样将获得含有50,000个细胞的培养物。将细胞培养板置于37摄氏度的培养箱中孵育两小时。两小时孵育结束后，开始计时，以确保打印样品与接种样品之间的一致性。

这被视为零小时时间点。在0、2、24和48小时后，通过碘化丙啶染色制备两种方法的细胞用于成像，碘化丙啶仅能进入死细胞的细胞核。首先，用一毫升含钙和镁的磷酸盐缓冲液轻轻冲洗细胞三次，以去除任何碎片。

接下来，向每个培养容器中加入一毫升预热的培养基，然后加入一微升碘化丙啶。用碘化丙啶染色的细胞在37摄氏度孵育10分钟，随后使用倒置显微镜在10倍和40倍放大倍数下观察细胞。最后将细胞弃置于适当的生物危害容器中。

将成纤维细胞系 NIH 3T3 细胞打印或接种到浸没的表面上。打印和接种后，在相应的时间点观察细胞以评估其密度和形态。结果显示，在每个时间点以及每个放大倍数下，细胞均表现出几乎相同的表型。

根据这些数据，确定有效打印量极低。通过碘化丙啶染色评估细胞活力，结果显示，在各个时间点，打印细胞的活力与对照细胞相比无显著差异。两种细胞贴附方法之间的主要区别在于细胞密度。

无论是贴壁细胞还是打印细胞，在两小时时间点的打印细胞密度均下降超过50%。需要进一步研究以确定密度下降的原因。然而，与接种细胞相比，打印细胞的整体密度比值仍然显著更高。

在每个时间点，流动池中打印的细胞密度大约是接种细胞密度的10倍，因为打印细胞的密度与接种密度相同，但分布面积更小。在最终时间点，细胞密度趋于一致，这可能是由于细胞运动性以及资源消耗限制所致。自该技术问世以来，已为药物发现等领域的研究人员提供了新途径，用于研究药物毒性与药效对细胞的作用，以及癌症、心脏病和其他高需求疾病领域的相关研究。

通过将悬浮细胞打印技术与黏附性控制、可编程细胞黏附等其他技术相结合，我们可以将该技术的应用范围扩展至悬浮细胞，从而用于更广泛的药物发现与开发筛选。观看本视频后，您应对如何使用我们的水下打印技术进行细胞打印具有扎实的理解。