适用于单颗粒冷冻电镜的用户友好、高通量、全自动数据采集软件

自动数据采集软件对于收集大量冷冻数据以进行生物大分子结构表征极为必要。本研究使用自动数据采集软件包对多种与病原体生物学直接相关的生物大分子结构进行了表征，例如分枝杆菌、HIV 和 SASCO 2。

首先，从开始菜单中点击 DigitalMicrograph，启动 Latitude-S 自动化数据采集软件。接着，选择技术管理器（Technique Manager），然后选择用于单颗粒自动化数据采集的 Latitude-S 图标。若要基于先前会话的设置创建新会话，请在面板中勾选“基于先前会话”复选框，然后点击“新建”按钮；若要继续现有的会话，则点击“继续”按钮。

要开始一个全新的会话，请点击调色板中的新建标签。选择包含要继续的会话的文件夹，并指定用于保存数据的文件夹。接下来，点击设置图标，在出现的受管状态浏览框中添加状态，设置透射电子显微镜（TEM）条件、相机条件以及图像或库存选项。

然后，命名该状态或打开状态设置摘要以保存设置。接下来，通过单击 Atlas 状态调色板来配置 Atlas 状态，设置放大倍数、照明条件和相机曝光时间等参数，然后单击下一步以进入下一个状态。接着，通过单击网格状态调色板来配置网格状态，设置显微镜成像光学参数、照明条件和相机曝光时间等参数，然后单击下一步。

通过点击孔洞调色板配置孔洞状态，并设置成像光学参数、照明条件、像素合并（binning）以及相机曝光时间参数。点击“下一步”后，通过点击聚焦调色板配置下一个聚焦状态，并设置显微镜的成像光学参数、照明条件、像素合并和相机曝光时间。随后聚焦于孔洞附近的无定形碳区域，然后点击“下一步”进入下一状态。

通过点击数据调色板配置数据状态，并设置显微镜参数，然后点击下一步。在给定的选项卡中，点击对焦配置调色板，指定离焦值的范围及步长，然后按下下一步按钮进入下一个步骤。对准网格上需要的特征，并点击捕获按钮。

然后将红十字标记放置在不同状态图像的同一特征位置上。首先处理聚焦（Focus）、数据（Data）和孔（Hole）状态，因为这些状态下的视野比图谱（Atlas）和网格（Grid）状态更大。接着，放大图谱和网格状态，将红十字标记放置在相同的特征位置上。

要计算五个不同状态之间的位置和偏移，并将这些位置和偏移反映到输出窗口，请点击“计算”按钮。点击“捕获调色板”，根据需要选择图集的尺寸，以覆盖整个网格或部分网格。要捕获图集，请在图集上导航，并根据冰层厚度选择相应的网格方格。

选择所需的网格方格后，点击“计划”按钮，并观察网格方格中的图块依次填充，表示每个网格方格已被捕获。点击“计划”按钮后，通过添加孔位位置来选择网格方格中的代表性孔。获取孔图像后，定义数据采集位置和对焦位置，并将该布局保存为模板。

单击“自动查找”，输入孔径大小，然后在程序中单击“查找”按钮，系统将根据直径自动识别孔。设置强度以去除网格方格和冰污染中的孔。通过自动查找添加选定和黄色标记工具后，单击纬度任务中的“计划”按钮。

根据使用 cisTEM 软件对运动校正后的显微照片进行的初步人工筛选，大部分数据均处于理想的信号范围内。此外，使用 cisTEM 对在不同离焦范围内采集的图像也进行了人工检查。 spike 颗粒通过人工挑选用于计算二维分类平均图像以进行结构可视化，结果强烈提示存在目标结构，但高分辨率结构表征仍需依赖相应的数据集来实现。

三维分类结果显示，刺突蛋白有一个RBD处于向上开放构象，其余所有RBD均处于向下闭合构象。刺突蛋白的1RBD向上开放构象采用C1对称性进行重构。刺突蛋白图谱以侧面、顶部和底部视图展示。

通过将原子结构拟合到电镜图谱中，可更清晰地观察侧链。RBD向下闭合构象采用C3对称性，并结合刺突蛋白三维优化模型及电镜图谱进行精修，原子结构拟合结果如图所示。刺突蛋白的中间构象被鉴定为S2亚结构域，其个体氨基酸残基的侧链得以显现。

结果表明，Latitude-S 可以采集生物大分子的高分辨率冷冻电镜数据。该自动化数据采集软件可用于其他任何电子显微镜系统，以实现数据的自动采集。