一种基于 cryoSPARC、RELION 和 Scipion 的稳健单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）处理流程

单颗粒冷冻电子显微镜技术是用于在接近原子分辨率下测定大分子结构的方法。目前有多种软件包可用于图像处理和结构计算，但由于计算过程中所采用算法的差异，所得三维图谱的质量和分辨率往往有所不同。因此，结合使用不同的程序通常有助于获得最佳结果。

本方案指导用户在三个不同的冷冻电镜处理平台——CryoSPARC、RELION 和 Scipion 之间导航工作流程。我们将演示如何使用该流程获得腺相关病毒的高分辨率结构，该病毒是基因治疗中广泛使用的一种载体。在网页浏览器中打开 CryoSPARC v3 并为项目创建工作区后，进入新建的工作区，然后在右侧面板中打开作业构建器。

单击导入视频，提供视频文件路径和增益参考文件路径。然后设置采集参数。接下来，单击队列，选择要运行任务的通道和工作区，然后单击创建。

打开补丁运动校正和导入电影作业卡片，然后将 imported_movies 输出拖动到新作业的电影占位符上，并排队该作业。要执行对比度传递函数（CTF）估计，请打开补丁CTF估计。

输入生成的显微照片并提交作业。为了检查经过平均和CTF校正的显微照片，并从中选择子集进行后续处理，请打开“筛选曝光”功能，输入上一步获得的曝光图像并提交作业。当作业进入等待模式后，点击作业卡片上的交互式标签页。

调整参数阈值，并对单个显微照片进行接受或拒绝，以进行后续处理。在处理当前数据时，将像散的上限阈值设为 400 埃，CTF 拟合分辨率设为 5 埃，相对冰层厚度设为 2。然后点击完成，以选择用于下游处理的显微照片。

对于基于手动挑选的方法，打开手动挑选工具。输入可接受的曝光图像，并将任务加入队列。然后点击交互式标签页，将框选尺寸设置为 300 像素，并在多张显微照片上挑选数百个颗粒，注意避开重叠的颗粒。

选择完成后，点击“完成挑选提取颗粒”。接下来，为生成用于自动挑选颗粒的模板，点击“2D分类”并输入已生成的颗粒挑选结果。然后将2D分类的类别数目更改为10，并提交作业队列。

接下来，打开并选择2D类别，输入上一步获得的颗粒图像和2D类别平均图。然后点击交互式标签页，选择信噪比较高的代表性2D类别，再点击完成。对于基于模板的颗粒挑选，打开模板挑选工具，输入所选的2D类别和显微照片。

然后将颗粒直径设置为220埃，并提交任务。最后，打开从显微照片中提取的文件，输入通过检查颗粒挑选结果获得的显微照片和颗粒。接着将提取的盒尺寸设置为300像素，并提交任务。

进行二维分类时，点击“2D分类”并输入已提取的颗粒。然后将二维类别的数量设置为50，并提交作业。接下来，打开“选择2D类别”，输入获得的颗粒及类别平均图像。

点击交互式标签页。根据分辨率和类别中的粒子数量选择2D类别，然后点击完成。要生成初始的3D体积，打开从头重构（ab-initio reconstruction），并输入最终2D分类的粒子。

然后将对称性调整为二十面体对称，并提交作业。接着，打开同质精修，输入上一步的重构体积以及最终二维分类的颗粒。随后更改对称性，并提交作业。

当作业完成后，检查傅里叶壳层相关性（FSC）曲线，并下载重构体积文件以在 UCSF Chimera 中进行观察。在 CryoSPARC v3 中，打开最终 2D 分类中“选择 2D 类”作业的作业卡片，然后在“详细信息”选项卡中，点击“导出作业”。

使用 PyEM，通过执行指定命令将 particles_exported.cs 文件转换为 star 格式。点击粒子提取后，在 I/O 选项卡中输入经 CTF 校正的显微照片和坐标。

然后点击提取选项卡，将粒子框大小更改为 300 像素并运行任务。对于三维精修，使用 CryoSPARC v3 中生成的图谱作为 RELION-3 中的初始模型。选择导入方法，并在 I/O 选项卡中设置指定参数。

然后在“其他”选项卡中，选择 CryoSPARC v3 地图作为输入文件，将节点类型更改为 3D 参考，然后运行任务。接下来，选择 3D 自动精修，在 I/O 选项卡中，将输入图像设置为上一次筛选任务生成的 particles.star 文件。

使用 CryoSPARC v3 重建结果作为参考图谱，点击参考选项卡，将初始低通滤波设为 50 埃，并将对称性设为二十面体对称。然后在优化选项卡中，将掩膜直径更改为 280 埃，并运行该任务。进行后续处理时，点击后续处理选项。

在 I/O 选项卡中，输入生成的半图和掩膜，并将校准后的像素尺寸设置为 1.045 埃。然后在增强选项卡中，对于自动估计 B 因子，输入 yes；对于自动 B 因子拟合的最低分辨率，输入 10。

若要使用您自己的 B 因子，请输入“no”。最后，在过滤器选项卡中，将“跳过 FSC 加权”设置为“no”，然后运行任务。对于 polishing 训练，请打开贝叶斯 polishing。

在 I/O 选项卡中，输入之前获得的经过运动校正的显微照片、颗粒以及 PostProcess.star 文件。点击训练选项卡，将“训练最优参数”设置为“是”，用于测试的傅里叶像素比例设为 0.5，并使用 5,000 个颗粒进行训练。

然后运行任务。训练任务完成后，点击贝叶斯优化。接着在训练标签页中，将“训练最优参数”设置为“否”。

选择抛光选项卡，在优化参数文件中指定上一步生成的 opt_params_all_groups.txt 文件路径，然后点击运行。为了估计高阶像差，请打开 CTF 精修。

在“输入/输出”选项卡的“颗粒”部分，选择包含最近精细3D任务中优化后颗粒的.star文件路径。然后在“后处理STAR文件”部分，设置最新后处理任务输出的路径。接下来，选择“拟合”选项卡，并将“估计各向异性放大倍数”设为“否”。

对CTF参数进行拟合，选择“否”。将估计束斑倾斜设为“是”，同时将估计三叶像差设为“是”。

然后估算四阶像差，确认无误后运行任务。为了进一步优化并验证 RELION-3 重构的结构图，启动 Scipion 3 并创建一个新项目。

在左侧的实验方案面板中，选择导入下拉菜单，然后点击导入粒子。将参数“导入自”更改为 RELION-3，并将 star 文件设置为 postprocess.star。随后按照之前演示的方式指定采集参数，然后点击执行。

接下来，单击导入下拉菜单并选择导入体积。在“从何处导入”选项下，提供 RELION-3 图谱的路径，将像素尺寸采样率更改为每像素 1.045 埃，并执行操作。为进行全局比对，从协议面板中选择优化下拉菜单，然后单击 xmipp3-highres。

将前几步导入的颗粒和体积分别作为全尺寸图像和初始体积输入，并将对称性设为二十面体对称。然后在图像比对选项卡的角分配部分，选择“全局”方法，将目标最大分辨率设为3埃，并运行该任务。若要执行局部比对，请选择xmipp3-highres全局方法，将“从上一次运行继续”设置为“是”，并选择上一个任务。

然后在角度分配选项卡中，将图像对齐方式更改为局部对齐，并将最大目标分辨率设置为 2.1 埃。完成后，在 xmipp3-highres 结果窗口中，单击显示分辨率曲线图以查看精修后 FSC 的变化情况，并单击绘制角度变化的直方图以检查欧拉角分配是否发生变化。在 UCSF Chimera 中检查该重构体积。

放大并寻找高分辨率特征。选择具有良好CTF拟合且像散较低的显微照片用于进一步处理，而像散较高或不符合要求的则被舍弃。选择包含结构清晰类别的二维分类平均图像，而分辨率低、噪声大或含有部分颗粒的图像则被剔除。

此处展示了将腺相关病毒的原子坐标拟合到冷冻电镜密度图区域的结果。清晰的电镜密度使得能够拟合单个氨基酸的侧链、水分子以及镁离子。使用 CryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 计算的 FSC 曲线显示了在整个处理流程中分辨率的逐步提升，结构在四个不同切片处的分辨率估计值以及分辨率直方图进一步表明了各密度图局部分辨率的逐步改善。

结合使用CryoSPARC、RELION-3、Scipion和Phoenix的冷冻电镜处理算法，使腺相关病毒结构在整个处理流程中的分辨率从2.9埃提高到2.3埃。需要牢记的是，每一步中设定的参数均依赖于样品和显微镜的具体情况。此外，能否达到高分辨率在很大程度上取决于样品质量和原始数据的质量。

在本视频中，我们展示了用于跨多种软件平台处理冷冻电镜数据的稳健 SP 工作流程。通过采用该方法，用户可在多个程序中实现算法，以优化和验证冷冻结构。该工作流程可应用于多种大分子组装体的结构计算。