通过去除单颗粒冷冻电子显微镜最终堆叠中的大部分颗粒以增强密度图

冷冻电子显微镜对于确定生物大分子的近原子结构至关重要。尽管该技术依赖于对大量低信噪比图像进行平均处理，但实现特定分辨率所需的最优颗粒数量仍不明确。这一局限性阻碍了样品分析和制备方法的发展。

为解决这一问题，我们引入了一种迭代分类方法。标准的流程筛选包括二维和三维分类。其他流程分类标准，如归一化互相关方法、角度图一致性方法以及非对齐分类，目前也正在应用中。

大量实验表明，CryoSieve 在 cryo-EM 粒子筛选算法中表现优于其他方法，揭示了最终堆叠中的大多数粒子是不必要的。保留在最终堆叠中的少数粒子即可在重构的密度图中产生非常高的分辨率振幅。对于某些数据集，最终子集的大小接近理论极限。

在冷冻电镜样品制备中，由于缺乏用于比较不同方案的标准指标，所选颗粒数与采集颗粒数的比值可作为评估质量的指标，分析这些颗粒在空间和时间上的分布也可能揭示影响制备效果的关键物理因素。为配置GPU加速环境，请打开终端并输入命令 nvidia.smi，确认该命令能成功显示GPU显卡的全部信息，且CUDA版本高于10.2。

然后执行命令 conda V 以确认 Conda 的安装。输入以下命令来设置虚拟环境，并等待几分钟，直到环境成功配置。执行命令 conda activate CRYOSIEVE_ENV，以激活新创建的虚拟环境。

安装 CryoSieve，请运行命令 pip install cryosieve。安装完成后，输入命令 cryosieve h，以确认帮助信息正确显示。从 NPR 下载 NPR 10097 最终堆叠数据集。

打开 GitHub，然后下载 star 文件和 mask.mrc 以及初始的 mrc 文件。将所有这些文件放在同一个文件夹中。

打开终端，使用命令 CD 文件路径导航到包含数据集的文件夹。然后输入 conda activate CRYOSIEVE_ENV 命令以激活 Conda 环境。使用以下命令启动颗粒筛选。

监视终端显示，查看每次迭代的输出日志。输入指定命令以打印10次筛选迭代的分辨率结果。第七次迭代中过滤的粒子堆栈分辨率最高，粒子数量最少，结果最优。

要导入已筛分的颗粒，请打开 CryoSPARC 网络界面。进入一个工作区，然后点击面板右上角的构建器按钮。接着选择并点击导入颗粒堆栈选项。

在粒子堆栈导入面板的参数部分，将粒子元数据路径指定为输出文件夹中的 _.nstar 文件，将粒子数据路径指定为包含 MRCS 文件的文件夹。点击 Q 作业按钮，然后点击 Q 按钮以启动该过程。

在 CryoSPARC 的右上方面板中，单击 builder 按钮，然后选择并单击导入 3D 体积选项。将体积数据路径指定为初始 MRC 文件。单击 Q job 按钮，然后单击 Q 按钮以启动该过程。

再次点击构建器按钮，并选择均一 refinement 选项。在左侧主面板中，打开用于导入第四次迭代粒子堆栈的作业。从主面板右侧拖动已导入的粒子模块，将其放置到构建器的粒子堆栈部分。

单击红色的 X 以关闭导入粒子堆栈任务。打开用于导入 3D 体积的任务。从主面板右侧拖动已导入的体积模块，将其放入构建器的初始体积部分。

在参数文件夹下，找到对称性选项并将其设置为 C3。查找并禁用强制重新计算 GS 分裂的选项。点击 Q 作业按钮，然后点击队列按钮以启动同质精修。当所有作业完成后，检查结果并确认第六次迭代中过滤的粒子堆栈提供了最佳结果。

展示了流感病毒血凝素三聚体数据集在应用本方法前后，用于壳层相关曲线的模型图、半图以及重建密度图的对比。同时，在应用相同等高线水平的情况下，对原始密度图与锐化后的密度图进行了比较。通过锐化图中侧链的对比，可明显看出重建密度图的提升效果。

在最终堆叠中去除大部分颗粒后，Rosenthal-Henderson B 因子从 226.9 Ų 提高到 146.2 Ų。局部分辨率、局部 B 因子和分辨率对数（res log）等参数表明，CryoSieve 能够同时提升密度图和颗粒的质量。