开源单颗粒分析软件VirusMapper用于超分辨率显微镜研究

本实验的总体目标是通过对带有荧光标记组分的结构进行超分辨率成像，并应用单颗粒分析方法，获得病毒或大分子复合物的高精度分子模型。该方法可解答病毒学领域中的关键问题，包括复杂病毒的蛋白质结构及其在感染过程中发生的变化。该技术的主要优势在于，通过采集同一结构的多幅图像，能够生成其组分的高精度定位图谱。

尽管该方法可提供有关病毒结构的信息，但也可应用于其他系统，例如其他病原体以及哺乳动物细胞内的大分子复合物。首先，使用超分辨率荧光显微镜对样品进行成像。获取多个视野的图像，每个视野应包含数百至数千个分离良好的颗粒，且无非特异性荧光结构。

获取并处理图像后，将图像导入并拼接成一个通道交替的图像序列。如有必要，将拼接后的图像从超图像序列转换为普通图像序列。接下来，在 VirusMapper 子菜单中选择“提取病毒结构”，并设置提取出的颗粒的文件路径。

填写成像的荧光通道数量。将参考通道设置为颗粒形态最一致的荧光通道。如果这些颗粒缺乏中心极大值，可应用检测前高斯模糊以使其呈现出中心极大值。

接下来，估算最大颗粒的直径（以像素为单位）。将感兴趣区域（ROI）的半径设置为略大于该值的一半。估算每帧所需的 ROI 数量。

最初使用的 ROI 数量不要超过一百个。根据颗粒间距设置最大 ROI 重叠度。预览该帧的 ROI。

调整半径、ROI 数量和最大重叠度，使帧中的每个颗粒都被单个 ROI 包围。确保 ROI 至少比最大的颗粒宽几个像素。然后，单击“确定”以运行分割。

提取完成后，在 ROI 管理器中关闭样本图像。不要重命名提取出的粒子集合。选择“生成种子”，然后打开包含提取粒子数据的文件夹。

设置参考通道，并选择所有需要生成种子的通道。如果需要与之前的模型匹配，可将种子旋转九十度。对于颗粒缺乏中心最大值的通道，如前所述，增加预对齐的高斯模糊值。

如果通道未紧密对齐，请为非参考通道启用偏移校正。在粒子序列中搜索持续出现的结构。确定一个代表性粒子，并在“要使用的帧”字段中输入相应的帧编号。

检查获得的种子。种子筛选是该流程中的关键步骤。仔细查看原始数据，以确定一个或多个待建模的结构。

模型质量在很大程度上取决于所选种子是否能准确反映这些结构。根据需要调整参考通道、高斯模糊半径和偏移校正，以优化识别出更多具有相似种子的图像帧。持续添加图像帧并调整生成参数，直至平均结构最能代表数据中观察到的结构为止。

输入种子的文件夹名称和文件前缀。单击“确定”以保存种子图像，用于后续建模。选择“基于种子生成模型”，并打开已提取的粒子文件夹。

加载每个通道的种子平均值。如果进行基于参考的结构发现，请选择一个参考通道用于比对。一个通道中已知的颗粒结构可作为参考，用于比对第二个未知通道。

这有助于对未知结构进行无偏映射。请注意，必须预先校正通道间的色差。如果分析旨在寻找模型中的微小差异或细微特征，则在模板匹配过程中应选择“方阵图像强度”。

将最小相似度设置在百分之六十至百分之八十之间，迭代次数设置为一次。选择在计算过程中显示的模型和粒子，并生成预览模型。检查预览模型。

提高最小相似度，以仅包含具有目标形态的颗粒。根据需要优化其他模型计算参数，并在模型生成过程中选择要显示的额外组分。当预览模型满意后，将迭代次数增加至十次。

设置文件夹名称和文件前缀。单击“确定”以保存包含最终模型所有迭代的模型演化堆栈。利用结构照明显微镜对一种重组痘苗病毒进行成像，该病毒含有两种分别标记了绿色和红色荧光蛋白的蛋白质，并使用 VirusMapper 插件对其进行建模。

分别针对冠状面和矢状面方向生成种子，每种方向的种子均来自五个代表性颗粒的平均结果。根据病毒的方向不同，可区分出一个或两个侧向体。因此，可针对这两种方向分别生成独立的模型。

在进行该实验流程时，需要牢记模型的质量在很大程度上取决于所获取原始数据的质量。尽管单颗粒分析可以提高分辨率，但它无法弥补图像质量低下的问题。完成本流程后，可对这些模型进一步进行定量分析或模型拟合。

这有助于回答有关感染过程中病毒结构在纳米尺度上变化的具体问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用单颗粒分析软件 VirusMapper，从超分辨率图像中生成分子结构模型。