用于活细胞超分辨率显微镜和单分子示踪的传统BODIPY缀合物

本方案描述了利用常规BODIPY染料的稀疏、红移状态进行超分辨率显微成像的方法。该方法使我们能够以30纳米的分辨率研究活细胞中的细胞器和生物分子。此技术的优势在于操作简便，且可利用多种现有的BODIPY偶联物，从而提供持久的单分子信号来源。

我们所展示的应用可能有助于深入理解脂肪肝疾病或2型糖尿病等疾病，其通过突破衍射极限来解析脂滴和脂肪酸。我们获得了关于酵母和哺乳动物细胞中脂肪酸及脂滴生物学的深入认识。然而，该技术同样适用于所有其他具有低背景荧光的透明细胞类型。

首次使用该技术时，务必优化二价离子浓度和激光功率，以观察到明亮的单分子信号。直观演示该技术对于理解二价离子浓度及激光功率优化如何产生明亮的单分子信号至关重要。将哺乳动物U2OS细胞培养于不含荧光物质的DMBM培养基中，培养基中需添加10%胎牛血清、4毫摩尔谷氨酰胺、1毫摩尔丙酮酸钠以及1%青霉素-链霉素抗生素，使用T-25培养瓶进行培养。

当细胞融合度达到70%至80%时，按1:1至1:5的比例进行传代，并接种至8孔板的单个孔中。将8孔板中的细胞培养12至24小时。成像前10分钟，加入100 nmol/L终浓度的BODIPY-C12溶酶体绿色荧光探针或其他BODIPY偶联物。

根据所用BODIPY的发射光颜色，在发射光路中安装适当的滤光片组。打开显微镜，开启显微镜载物台、488纳米和561纳米激光器以及相机。

在显微镜物镜上滴加一滴浸油。打开用于控制明场成像LED光源、激光功率、激光快门以及成像相机设置的HAL4000软件。将EMCCD增益设为30，相机温度设为-68摄氏度。

准备相机及相应软件，以每秒20帧的速率录制视频。打开显微镜载物台加热器，并将其温度设置为37摄氏度，二氧化碳浓度设置为5%。相应调整物镜的色差校正。

将样品安装在显微镜载物台上并调焦，直至对焦系统启动。使用载物台控制器移动载物台，直到视野中出现健康的细胞。加载用于激发单体（monumus）以及二聚体（dimers）的激光快门序列，设置561纳米激光器的激光功率为821千瓦每平方厘米，用于单分子定位显微镜成像，从而在红移发射通道中检测单分子荧光信号。

将488纳米激光器的激光功率调节至0.35至0.7瓦特每平方厘米之间，使常规荧光出现在绿色发射通道中。为视频选择目标文件夹，并采集5000至20000帧图像，以获得足够的定位点用于重构超分辨率图像。移动至不同的视野并重复该过程，以收集更多细胞的数据。

将视频载入单分子定位显微镜分析软件中。通过肉眼观察视频并调整对比度设置，使单分子荧光闪烁信号可见。设置单分子识别参数，用于拟合二维高斯点扩散函数（PSFs）。

通过目视检查若干示例帧来评估识别参数，并可靠地检测出明显的单分子荧光爆发信号。按下“分析”按钮，使用优化后的识别参数进行单分子定位显微成像分析。随后，将每个单分子渲染为一个二维高斯函数，其宽度由所检测到的光子数的平方根的倒数加权。

评估数据质量。使用限定的帧范围来观察更特定时间点的单分子分布情况，以校正数据采集过程中细胞器的移动。

本研究中，我们介绍了一种利用BODIPY偶联物进行单分子定位显微镜成像的优化样品制备、数据采集与分析流程。为展示单分子定位显微镜数据获取与分析的工作流程示例，采用酵母中的BODIPY实现对光学衍射极限以下脂滴的分辨。本文还展示了BODIPY与其他探针（如GFP和mEos2）联用时不同多色成像模式的示例。

禁食条件下，BODIPY-C12 在细胞周边形成可移动的非脂滴簇，而在进食条件下则被整合至脂滴中。为了进一步拓展 BODIPY 偶联物在哺乳动物细胞中的单分子定位显微镜成像能力，研究人员对活 U2OS 细胞中的 BODIPY-C12 和 Lysotracker Green 进行了成像。优化 BODIPY 的浓度以及激光激发功率是观察明亮单分子信号并重建超分辨率图像的关键步骤。

该方法可与任何其他BODIPY偶联物联用，以高分辨率揭示活细胞内特定生物分子在时空分布上的精细特征。我们的技术为在纳米尺度上进一步探究脂滴和脂肪酸生物学奠定了基础。然而，由于存在多种功能化的BODIPY偶联物，该应用范围远不止于特定的生物学过程。

请务必遵守生物样本和染料处理的标准操作规程，同时作为我们的义务对冲者，遵守激光安全操作规程。