用于临床前心脏风险评估的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞结构与收缩变化的杂交细胞分析系统

该方法可利用基于真实人体的数据回答临床前心脏安全性和毒性相关问题，从而推动新药候选物安全进入临床阶段。与采用多种不同的体外和体内技术不同，该混合系统的主要优势在于能够同时评估由人诱导多能干细胞（iPC）衍生的心肌细胞的电生理和活力参数，并在生理条件下分析其收缩特性。该方法适用于药物发现，因为它涵盖了心肌细胞的电生理、结构和收缩性变化，并具备高通量系统，可同时检测69个孔。

开始包被培养板时，将收缩力检测板的底部用额外提供的膜保护层覆盖，直至在收缩力检测模块中进行测量。接种心肌细胞前，通过将2.75毫升即用型EHS凝胶溶液和8.25毫升含钙镁的DPBS转移至无菌离心管中，配制稀释的EHS凝胶包被溶液，然后混匀该溶液。

从收缩板上取下膜保护罩。将制备好的包被液转移至实验室自动化机器人中的无菌试剂储液槽中。使用程序，通过实验室自动化机器人向每个孔中加入100微升包被液。

然后将盖子重新盖回96孔板上，在37摄氏度下孵育3小时。细胞解冻并计数后，根据细胞生产商的说明书，用推荐的铺板培养基调整细胞浓度，使每11毫升含有11 × 10⁶个细胞，以用于接种整块96孔板。使用程序移除100 µL，通过实验室自动化机器人从各孔中移除EHS凝胶溶液。

接下来，将11毫升细胞悬液转移至放置在实验室自动化机器人中的无菌试剂储液槽中，并每孔接种100微升悬液。使用程序设定，每孔加入100微升细胞悬液。细胞接种后，立即将可弯曲的96孔板转移至37摄氏度、5%二氧化碳、湿度可控的培养箱中，静置过夜使细胞贴壁。

将50毫升离心管中的22毫升心肌细胞维持培养基预热至37摄氏度，用于每块培养板。接种培养板后18至24小时，将新鲜培养基转移至无菌试剂储液槽中，并放置于实验室自动化机器人旁。随后运行程序进行换液，移除100微升培养基。

接下来，将装有新鲜培养基的试剂储液槽放入实验室自动化机器人中，通过程序向每个孔中加入200微升新鲜培养基，分两次进行，每次100微升，以达到每孔200微升。培养基更换后，立即将培养板转移至培养箱中。

每隔一天更换一次培养基，直至添加化合物。在添加化合物前4到6小时，进行最后一次换液：将22毫升新鲜且预热的检测缓冲液转移至无菌试剂储液槽中，并将其放置在实验室自动化机器人旁。换液后立即将柔性培养板放回培养箱中。

在基线测量前一小时，将培养板转移至相应的测量设备。在控制软件中打开“编辑协议”，选择相应的测量模式：Flex Site 或 Impedance EFP。定义扫描持续时间或单次测量时长为 30 秒，重复间隔为 10 分钟，然后保存协议编号。

然后选择“开始方案”并继续填写所需字段。参数设置完成后，选择“开始测量”。在加入化合物前的短时间内，以五分钟间隔至少进行三次基线测量。

根据测量方案，从测量装置中的柔性96孔板各孔中移除50 µL测定缓冲液，注意不要将整块板从测量装置中取出，随后向每孔加入50 µL浓缩四倍的化合物溶液。加入化合物后，选择“添加试剂标记”以定义化合物板的布局及化合物溶液的体积。然后根据实验方案选择“继续标准测量”或“继续测量系列”。

代表性分析显示了激酶抑制剂厄洛替尼对人iPSC来源心肌细胞收缩力的影响。在最低浓度下，厄洛替尼引起振幅的下降，但无统计学意义；而在微摩尔浓度下，厄洛替尼表现出时间和剂量依赖性的心脏毒性效应。使用1微摩尔厄洛替尼处理96小时后即可观察到效应的 onset，而10微摩尔厄洛替尼处理则在给药后24小时即导致显著的收缩振幅下降。

加入10微摩尔浓度的表柔比星后，细胞在24小时内停止搏动。加入1微摩尔浓度的表柔比星后，24小时后搏动幅度显著下降，并在48小时内完全停止搏动。在100纳摩尔浓度下，观察到搏动幅度随时间依赖性降低。

在最低浓度为10纳摩尔时，振幅保持稳定波动，证实表柔比星的作用仅具有剂量依赖性。使用多柔比星和硝苯地平处理24小时后，细胞活力的降低呈浓度和时间依赖性。随着硝苯地平浓度逐步增加，对细胞进行的场电位记录显示，标准化后的场持续时间呈浓度依赖性缩短。

关于尼非地平对心肌收缩力的评估也显示，在急性测量中，10 纳摩尔和 13 纳摩尔浓度下，收缩幅度显著降低，且呈浓度依赖性。需要注意的是，细胞通常对环境参数（如温度和 pH 值变化）以及机械刺激较为敏感，而收缩板特别有助于提供机械刺激。