一种用于癫痫建模的多电极阵列平台：基于人多能干细胞衍生脑类组装体

在过去几十年中，基因发现的迅猛发展已确定了数百个导致或与癫痫相关的基因。然而，其致病机制尚未得到充分研究。本实验室致力于研究基因改变如何影响早期大脑发育，进而导致脑部畸形和癫痫——一种以慢性癫痫发作为特征的致残性疾病。

遗传性癫痫通常采用动物模型进行研究，包括小鼠、斑马鱼和兔子。随着将干细胞分化为神经组织的技术不断进步，人类干细胞也已较近用于建立遗传性癫痫的模型。随着脑类器官技术的出现，能够重现大脑发育的某些结构特征。

测量脑类器官和类组装体的电生理活动，并从中确定与癫痫相关的生物标志物具有挑战性。部分原因是脑类器官无法像完整动物那样产生癫痫发作。尽管如此，在这种体外模型中发现电生理差异以及对药物治疗的反应，可能有助于阐明遗传性癫痫的病理机制及治疗反应。

可以通过传统的膜片钳记录、使用电极的局部场电位记录以及钙成像和记忆电压成像等光学技术来评估电生理活动。使用多电极阵列记录的优势在于能够随时间进行长时间的记录，并可同时从类组装体的多个位置获取信号。首先，利用命运特异性的脑类器官生成被病毒标记的类组装体。

为进行MEA表面预处理试剂的配制，将0.5克去污酶粉末溶解于50毫升去离子水中。充分涡旋混匀直至粉末完全溶解，并在生物安全柜内使用无菌管顶式真空滤器对溶液进行灭菌。取500微升7%聚乙烯或PEI储备液，加入49.5毫升一倍浓度的Xbore 8缓冲液中稀释。

配制0.07%的PEI溶液。在生物安全柜内，使用0.22微米滤器对溶液进行过滤除菌。随后，向无菌MEA板的每个孔中加入1毫升1%的洗涤剂酶溶液，并在37摄氏度下孵育2小时。

然后从每个孔中移除去污剂酶溶液，并用每孔1.5毫升无菌去离子水洗涤五次。每孔加入一毫升培养基进行预处理。将MEA板放回37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中培养两天。

孵育后，从孔中移除培养基，并加入50微升0.07% PEI溶液以覆盖MEA电极，进行初步包被。将培养板在37摄氏度下孵育一小时。然后彻底吸出每孔中的PEI溶液。

用一毫升无菌去离子水洗涤每个孔三次。吸去水分后，在生物安全柜中将培养板敞盖于室温下干燥15分钟。随后，在每孔的电极区域覆盖50微升基底膜基质，该基质用培养基按1:20（体积比）稀释，用于二次包被。

将MEA板放回37摄氏度培养箱中过夜。次日，吸去稀释的基质溶液，仅在表面保留一层薄层。若形成较厚的层，使用AP 1,000移液枪头用力向电极接触区域喷射培养基。

然后使用带有宽口切割的 AP 1,000 枪头，从培养皿中收集一个类组装体，并在转移尽可能少的培养基的情况下，小心地将其放置在孔中电极的上方。将培养板置于超净台内的解剖显微镜下，使用无菌的 P20枪头，小心地将类组装体推至目标位置。用 P20 枪头去除类组装体周围的多余液体。

孵育结束后，从培养箱中取出培养板。然后在体视显微镜下观察，在类组装体上方加入2至3滴用培养基稀释1至50倍的基底膜基质，再将培养板放回培养箱继续孵育30分钟。随后，在体视显微镜下小心地在类组装体附近加入3滴培养基。

第二天，在解剖显微镜下检查类组装体是否已沉降并稳定。每孔加入 750 微升培养基，使总体积达到每孔 1 毫升，并将培养板在培养箱中静置至少两天。此后每周，小心地从每孔中移除 500 微升培养基，然后向每孔中加入 700 微升新鲜的神经生理学基础培养基。

与第78天相比，第92天观察到网络簇状放电持续时间增加，这可能是由于神经元成熟所致。细胞及网络活动在第125天时逐渐减弱。