人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中微电极阵列与膜片钳记录的技术应用

心脏安全性评估是药物研发过程中的关键环节。人诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞已被证实是一种可靠、高效且基于人体的临床前心脏安全性评估模型。我们已建立了一系列方法，用于全面研究人iPSC来源心肌细胞的功能特性，这些方法在重要疾病建模、药物诱导心脏毒性筛选以及精准医学中具有重要意义。

将人iPSC来源的心肌细胞越来越多地纳入标准的临床前安全性评价流程，有望提高对候选化合物毒性预测的准确性。在进行检测前，需先将人iPSC来源的心肌细胞培养至少10天。打开温度控制器，并将其设定为37°C。

打开显微镜、相机和二氧化碳供应。向培养板支架的水套中加入适量无菌去离子水。将96孔板放置在板架上，并将细胞孵育至少五分钟。

打开观察软件，将相机帧率设置为每秒75帧，视频或图像分辨率为1024 × 1024像素。启用自动聚焦和自动亮度功能，记录由人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的视频和图像。在48孔微电极阵列板每个孔的记录电极区域上，小心地滴加8 µL细胞外基质包被溶液。

然后向孔周围区域加入三毫升无菌去离子水，以防止包被溶液蒸发。使用200微升移液枪头，在不接触电极的情况下，移除同一行或同一列中各孔表面大部分的细胞外基质培养基。在记录电极区域上，用八微升接种培养基液滴，每孔接种50,000个细胞。

重复操作直至所有孔均接种细胞。然后将微电极阵列板放入湿润的细胞培养孵育箱中孵育。缓慢向微电极阵列板的每个孔中加入150 µL铺板培养基。

接种后第10天，在显微镜下检查人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层的自发搏动密度。将48孔微电极阵列板放入记录仪器中。确保温度为37摄氏度，二氧化碳浓度为5%。打开导航软件。

在实验设置窗口中，选择心脏实时配置和场电位记录。应用自发性或粘贴搏动配置。在搏动检测参数中，将检测阈值设为 300 微伏，最小搏动周期设为 250 毫秒，最大搏动周期设为 5 秒。

选择多项式回归法用于场电位持续时间的计算。检查基线电活动信号是否成熟且稳定，并采集一到三分钟的基线心脏活动数据。在铺板后第10天进行记录。

将人iPSC-CM维持培养基更换为Tyrode's溶液，让细胞适应15分钟。将温度传感器插入腔室，并将35毫米培养皿放入其中。调节温度至37摄氏度。

使用微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制微电极。用细胞内液填充微电极，并将其插入连接至膜片钳放大器前置放大器的电极 holder 中。打开数据采集软件，加载动作电位记录程序，并选择电压钳制模式。

将微量移液器插入灌流液中，选择合适的人单个iPSC来源的心肌细胞。使用显微操作器调节并降低微量移液器的位置，使其靠近选定的细胞。当移液器尖端插入灌流液中后，通过示波器监视器检查移液器的阻抗。

将移液管靠近细胞，此时电流脉冲会略微减小，反映出封接电阻的增加。施加轻柔的负压吸力以进一步提高电阻，从而形成吉欧封接（gigaseal）。

然后应用封接功能，施加额外的负压以破裂膜片，获得全细胞记录构型。此时，通过放大器对话框切换至电流钳模式，或不进行电流注入。

按下记录按钮以生成并保存动作电位记录文件。在铺板后至少 10 天进行钙瞬变测量。配制新鲜的台氏液和 Fura-2 AM 负载溶液。

吸弃人iPSC CM维持培养基，用Tyrode's溶液洗涤培养室两次。加入100微升Fura-2 AM负载溶液，在室温下孵育10分钟。将Fura-2 AM负载溶液替换为Tyrode's溶液，并继续孵育至少5分钟，以确保Fura-2 AM完全去酯化。在倒置落射荧光显微镜的40倍油镜物镜上滴加一滴浸油。

将细胞腔室放入显微镜的载物台适配器中。将温度控制器导线连接至灌流腔室，并将其设定为37摄氏度。安装电场刺激电极，将脉冲设置为0.5赫兹，持续时间为20毫秒。

打开超高速波长切换光源，并将其设置为340纳米和380纳米的快速切换模式。两种波长的曝光时间均设置为20毫秒，记录时间为20秒。记录反映钙瞬变实时变化的视频，并将数据导出至电子表格进行分析。

采用人诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞单层进行收缩运动测量。利用分析软件对收缩-舒张运动轨迹进行分析，可检测到收缩起始点、收缩峰值点、收缩终止点、舒张峰值点以及舒张终止点。在微电极阵列板的所有电极上均观察到人诱导多能干细胞来源的心肌细胞单层完全覆盖。

每个电极记录到的成熟波形反映了具有可识别特征的心脏场电位。经分析后，获得了搏动周期、场电位持续时间和锋电位幅度。采用电流钳模式进行全细胞膜片钳记录，可记录单个心肌细胞的自发动作电位。

分析后获得了多个参数，包括动作电位幅度、最大舒张电位和动作电位持续时间。钙成像分析后，得到了随时间变化的F340/F380比值，并绘制了刺激诱导的钙瞬变原始轨迹。此外，还获得了幅度、舒张期钙水平和钙衰减时间常数等参数。

使用处于良好搏动状态的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞非常重要，同时需确保人诱导多能干细胞来源心肌细胞的高纯度。本方案包含四种特定技术，用于研究人诱导多能干细胞来源心肌细胞的功能性、其他构型或自动性，以及研究在心脏活动中起关键作用的心脏离子电流