使用非交联、无甲醛组织固定剂进行HER2 FISH的实验方案：结合冷冻保存与甲醛固定的优点

个体化医疗需要从经典组织学至分子分析等多种类型的检测，通常需对肿瘤样本进行多种原位技术分析，以选择最佳治疗方案。这些检测技术使得仅用一份样本即可开展多种分析。本文展示了一种在简单的福尔马林后固定步骤中使用非交联性固定剂的方法，表明原本为福尔马林固定及石蜡包埋组织开发并验证过的实验方案，也可应用于细胞样本，从而获得良好的形态学结构、高质量的RNA，以及完整的原位杂交结果。

典型的杂交条件不适用于无甲醛固定的组织以获得FISH结果。我们发现，对于果胶固定组织获得可比的FISH结果，关键因素并非通透性，而是化学校正时间。仅用于FISH的切片经过了甲醛固定和后续固定处理。

不含甲醛固定的组织相较于福尔马林固定石蜡包埋（FFP）组织，可实现更优的分子分析，这一点已通过逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）得到证实。本实验步骤由本实验室技术员 Daniela Pabst 演示。首先，使用无菌手术刀将乳腺癌组织样本切成两半，每部分厚度为四毫米，以确保足够的组织量。

固定时，组织大小不得超过 4×15×15 毫米，可采用标准缓冲福尔马林溶液，或采用其他非交联、无福尔马林的组织固定方法。将肿瘤标本的一半放入标准组织包埋盒中，并浸入 SBFS 溶液。将肿瘤标本的另一半置于替代固定液中固定 24 小时，固定液体积与组织体积之比为 4:1。

然后，打开容器，将组织包埋盒旋转180度并浸入稳定剂溶液中，将经替代固定法处理的样本置于其中孵育2至72小时。接着，将经SBFS固定后的组织包埋盒放入盛有70%乙醇的容器中，在室温下放置30分钟，以去除残留的SBFS。按照文本方案中所述进行组织处理和包埋后，使用切片机对FFPE和NCFPE蜡块进行三微米厚度的切片。

将每种类型的切片各取一部分放入冷水中。用细毛笔将漂浮的切片转移到载玻片上，再移入温水中。然后再次用毛笔将展开的切片无皱褶地转移至载玻片上。

同时准备进行RNA提取，以便对同一样本进行逆转录PCR分析，方法是将每种类型的切片各取一部分放入反应管中。对于组织切片的脱蜡处理，我们使用装有250毫升不同试剂的染色缸，在室温下逐步对切片进行水化处理。首先将切片置于100%二甲苯中两次，每次15分钟，然后将切片转移至96%乙醇中两次，每次15分钟。

接下来，将切片依次经过浓度逐步降低的乙醇溶液，每种溶液中孵育两分钟。最后，将切片转移至蒸馏水中两次，每次10分钟。通过将NCFPE载玻片放入盛有SBFS的新染色缸中，在室温下固定24小时，进行后续固定。

将罐子置于通风橱中，完成24小时的后固定步骤。令人意外的是，所有超过18小时的后固定时间所得到的结果均与甲醛固定石蜡包埋材料的结果相似。用磷酸盐缓冲液洗涤载玻片，每次10分钟，重复三次，以去除载玻片上多余的SPFS。

随后用蒸馏水再清洗两次，每次10分钟。接下来，将含有250毫升柠檬酸预处理加热溶液的染色缸置于98摄氏度的水浴中。将水化后的FFPE组织置于经后固定的NCFPE载玻片中，放入染色缸内，孵育15分钟。

然后，在新的染色缸中，用蒸馏水在室温下清洗载玻片3分钟。进行蛋白酶消化时，将载玻片放入温度可控的杂交仪中，设置温度为37摄氏度。立即以滴加方式将即用型胃蛋白酶溶液加至组织切片上，直至完全覆盖组织。

然后，在杂交系统中于 37 摄氏度孵育九分钟。接着，将载玻片放入含有 SSC 洗涤缓冲液的容器中，孵育五分钟。最后，将载玻片置于室温下的蒸馏水中一分钟。

将切片依次浸入梯度酒精中进行脱水，每级酒精处理一分钟。脱水完成后，将切片置于空气中干燥。进行杂交时，取10微升混合的HER2和sun 17探针，用移液器滴加至干燥的组织切片上，每张样本加盖盖玻片，并用橡胶胶水密封。

在杂交体系中，于75摄氏度下变性探针和标本DNA 10分钟。杂交体系自动降温至37摄氏度，杂交过夜进行。次日，用镊子小心移除橡胶胶水及盖玻片，以进行杂交后处理及保护。

将样本在含有37摄氏度预热的1×缓冲液A的染色缸中孵育5分钟。接着，在27摄氏度下用预热的1×洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次5分钟。然后将载玻片依次在70%、90%和100%乙醇中脱水，每个浓度各1分钟。

将样品在空气中干燥，并避光保存。染色时，在杂交区域滴加30微升DAPI溶液，避免产生气泡。盖上盖玻片，于避光条件下孵育15分钟。

用滤纸轻轻按压载玻片以除去多余的 DAPI 溶液。将载玻片置于 2 至 8 摄氏度避光环境中保存，最多可保存两周，随后进行共聚焦显微镜观察。使用绿色和橙色通道的滤光片采集图像。

按照文本方案中所述进行数据解读和RNA质量评估。此处显示的是来自经甲醛固定样本与经后续固定处理的非交联固定样本结果的直接比较。两者信号强度相似，背景也相似。

在正常的间期细胞中，对应于 HER2 基因座和 cen 17 参考基因座的红色和绿色信号数量相等，表明 HER2 基因无扩增。此处显示的是另一病例的结果，其中 HER2 基因发生扩增，HER2 基因座的信号比参考基因更强且更宽。该现象在固定前和固定后、以及非交联固定的组织中均明显可见。

该图显示了GAPDH mRNA不同扩增片段长度的扩增效率。对于甲醛固定的样本，大约需要23个循环；而对于非交联固定材料，则减少至20个循环。在较长的扩增片段中，这种差异更为明显，表明使用非交联固定剂可显著降低RNA的断裂和化学修饰。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过在分析前处理过程中增加一个简单的后固定步骤，使用经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的试剂对非交联固定材料中的FFPN样本进行检测。该技术的主要优势在于，仅用于全义链原位杂交的切片需要经甲醛后固定，而剩余的组织块则保存在非交联固定液中，因此可用于广泛的分子分析。当需要从相对较小的肿瘤组织中进行多种检测，且无法对同一样本分别按不同方案处理时，该方案在现代个体化医疗背景下尤为实用。

此外，使用非交联固定剂的优点在于其能够保留组织的特性，类似于冷冻保存的效果。这避免了需要使用液氮冷冻以及在化学环境中维持冷链的必要性。这些在RNA质量上的差异并不明显，因此在使用传统的RNA质量控制检测方法（如RNA完整性数值）时，由于这些检测方法对于从固定及石蜡包埋材料中分离的RNA质量评估并不完全有效。