相关超分辨率显微镜与电子显微镜技术解析斑马鱼视网膜中蛋白质的定位

本显微技术的总体目标是通过关联超分辨率显微镜与扫描电子显微镜图像，精确定位幼年斑马鱼视网膜中蛋白质表达相对于不同亚细胞器的空间位置。该方法有助于解答视网膜发育和细胞通路研究领域中的关键问题，例如突变体中蛋白质错误定位的研究。该技术的主要优势在于，它将超分辨率显微技术与扫描电子显微技术相结合，从而在样品的结构背景下获得高度精确的蛋白质定位数据。

在硅晶圆上收集Tokuyasu切片可显著改善样品操作性，而采用铂金喷镀技术提供反差则能获得良好的样品表面形貌。因此，该方法可为斑马鱼幼体视网膜研究提供重要信息。其主要优势之一在于，该技术还可广泛应用于其他多种生物系统，例如小鼠组织中蛋白质表达的鉴定。

根据文本方案从固定后的斑马鱼幼鱼中解剖出眼睛后，将15毫升含12%本地食品品牌明胶的PBS溶液在40摄氏度下预热。然后吸除眼组织管中的PBS，并加入明胶溶液。轻轻敲击管壁，确保明胶充分渗透样品，在40摄氏度的恒温金属块中轻轻振荡或置于水浴中孵育10至30分钟。

在40摄氏度的水浴中，将温热的明胶倒入尺寸为12×5×3毫米的硅胶或聚乙烯平底包埋模具中。然后使用移液器向每个模具中加入两只眼球，并在双目显微镜下用解剖针将其正确排列。让明胶在室温下冷却1分钟，随后置于4摄氏度环境中20分钟以使其凝固。

在双目镜下，使用剃刀重新修整明胶包埋块，使每个包埋块容纳一只眼球。将包埋有眼球的明胶块转移至冰上含有2.3摩尔蔗糖的PBS溶液中。将样品在4摄氏度下孵育过夜。

然后将样品置换到新鲜的2.3摩尔蔗糖溶液中，并在4摄氏度或-20摄氏度下保存，可保存数月。在将凝胶块转移至冷冻针之前，重新修整其大小，使其接近眼球的尺寸。

然后将样品块在液氮中冷冻，并转移至冷冻超薄切片机中。在冷冻超薄切片机中使用金刚石刀于零下120摄氏度下切出厚度为110纳米的切片。用含有2%甲基纤维素和2.3摩尔蔗糖溶液液滴的金属丝环捞取切片。

然后将切片转移至7 mm × 7 mm的硅片上。清洗硅片时，用移液器滴加四滴液体，并将硅片倒置放在液滴上。将硅片在0 °C条件下孵育20分钟。

然后在室温下用 PBS 洗涤晶片，每次 2 分钟，共洗涤两次。将样品在含 0.15% 甘氨酸的 PBS 中孵育，每次 1 分钟，重复三次。随后用 PBS 洗涤样品，每次 1 分钟，共洗涤三次。

用PBG预孵育组织5分钟。接着，将兔抗Tom20抗体溶于PBG中并加入切片。室温下孵育切片30分钟。

使用PBG洗涤组织，每次洗涤1分钟，共洗涤6次。然后在室温下用PBG预孵育样品5分钟。将PBG替换为含Alexa 647标记的兔源二价Fab片段的PBG溶液，孵育30分钟。

用PBG清洗样品，每次清洗1分钟，共清洗六次。然后用PBS清洗晶圆，每次2分钟，共清洗三次。向晶圆中加入DAPI和PBS，孵育10秒。

然后用 PBS 每次清洗样品 2 分钟，共清洗两次。将晶圆置于一滴由 80% 甘油与含氧清除系统的成像缓冲液按 1:1 比例配制的溶液上，短暂孵育。将晶圆转移至玻璃底培养皿上的一滴新鲜的 80% 甘油与成像缓冲液 1:1 混合液中，组织面朝下放置。

从晶圆片下方各个方向使用移液器吸除大部分液体。然后使用硅胶条将晶圆片固定在培养皿底部。将安装好的切片置于倒置显微镜上，使用高数值孔径的油浸物镜进行观察。

成像前，让样品在显微镜温度下平衡，以最小化或减少横向和轴向漂移。将目标区域置于视野中心，并采集宽场落射荧光参考图像。切换至超分辨率工作模式。

将相机的曝光时间调整为15毫秒，并将电子倍增增益设置为最大值300。接着，以最大激光功率在落射荧光模式下用642纳米激光照射样品。一旦单个分子的闪烁在每帧图像中充分分离，使得单个信号重叠的概率较低时，立即将激光功率降低至接近原来的1/3。

通过采集至少 30,000 帧图像，在落射荧光模式下记录原始图像。在“工具”菜单下的“时间序列分析”中，使用 30 个光子的检测阈值对原始数据进行处理。单击“评估”以生成定位事件列表。

在“工具”下的“事件列表处理”面板中，点击“创建图像”，通过高斯拟合可视化超分辨率图像，并应用4纳米的渲染像素尺寸。移除硅胶条带，然后在晶圆边缘附近滴加一滴PBS，使其从培养皿中抬起。用PBS洗涤晶圆两次，每次两分钟，随后使用含0.1%戊二醛的PBS溶液进行后固定，固定时间为五分钟。

然后用 PBS 再次清洗样品，每次清洗 2 分钟，共清洗两次。将晶片置于冰上，每次加入一滴含 2% 甲基纤维素的水溶液，孵育 5 分钟，共孵育两次。然后将晶片放入离心管中，在 14,100 ×g 条件下离心 90 秒。

离心后，使用导电碳胶将晶圆固定在扫描电镜用铝制样品台（SEM铝 stub）上。利用电子束蒸发仪，在以下条件下通过旋转阴影法在样品表面镀上一层2至10纳米厚的铂碳膜。使用扫描电子显微镜在1.5千伏加速电压、2毫米工作距离下，并配合镜内二次电子探测器对样品区域进行成像。

通过点击“文件”、“打开”，使用 Fiji 打开明场显微镜图像和电子显微镜图像。通过点击“图像”、“调整”、“画布大小”来调整画布尺寸。然后通过点击“图像”、“堆栈”、“图像成堆栈”将两幅图像合并为一个堆栈。

在 Fiji 中，通过点击“文件”、“新建”、“Track EM2 新建”来打开一个新的 Track EM2 界面。通过在黑色窗口上右键单击并选择“导入堆栈”，导入包含两幅图像的堆栈。使用鼠标右键单击图像，选择“对齐”、“手动使用标志点对齐图层”，通过标志点手动将光学显微镜图像与电子显微镜图像对齐。

选择“选择工具”以添加标记点。以细胞核的形状为参考，在两幅图像中选择相同的边缘，并添加多个点。通过右键单击，选择“应用变换”中的“仿射模型”进行配准。

最后，调整图层透明度以评估配准质量。该图显示了受精后五天斑马鱼视网膜切片的低倍宽场图像。相同区域在此通过扫描电子显微镜显示。

这些高倍放大图像显示了线粒体上红色的 Tom20 染色信号，呈现出簇状分布。此处 Tom20 的表达通过 GSDIM 显微镜检测获得。该图像在同一区域结合了相关联的超分辨率显微成像与扫描电子显微成像。

Tom20 染色信号出现在线粒体的外膜，位于线粒体簇内。细胞核中的 DAPI 荧光信号与扫描电镜图像的拓扑结构相对应。该扫描电镜图像为 GSDIM 图像中 Tom20 染色提供了背景信息。

线粒体嵴清晰可见，Tom20 染色定位于线粒体的外膜。光感受器外段的膜结构也清晰可辨。在进行该实验操作时，务必尽可能优化标记和成像参数。

只有标记效果最佳的样本才适用于超分辨率成像。在标记过程中，样本任何时候都不得干燥。该方法可扩展用于双重标记免疫荧光，从而实现对特定结构内两种不同蛋白质的定位。

对于更复杂的样品，建议使用标记物以获得图像的精确对齐。观看本视频后，您应能够充分理解如何在复杂组织样品中以超分辨率精度开展相关性研究，以定位蛋白质相对于细胞内不同细胞器的分布情况。