集成出口分流功能的多通道灌注生物反应器用于动态细胞培养

该方法有助于理解分泌速率如何随时间变化，以及细胞如何响应随时间变化的固相信号。该技术的主要优点是成本低、所需培训少，且灌注系统装置可针对新实验进行调整。首先，用背景溶液填充一支注射器，并将其装入第一台注射泵中。

用示踪溶液填充另一支注射器，并将其装入第二个注射泵中。使用鲁尔接头将两支注射器连接至三通旋塞阀的三个端口中的两个。关闭通往背景溶液的旋塞阀，泵入示踪溶液直至液体从开放的端口滴出。

停止泵的运行，不要再调整注射器。确保注射器泵的移动杆已紧贴注射器的推杆，以便在启动泵时流体立即开始流动。关闭通往示踪剂溶液的旋塞阀，泵入背景溶液至旋塞阀，直至将开放端口中的所有残留示踪剂溶液冲洗干净。

停止泵运行，不再调节注射器。搭建所需的用于停留时间分布（RTD）分析的流动系统组件。将末端插入移液枪头盒中，并泵入背景溶液通过该组件，直至其完全充满。

将示踪剂溶液的泵设置为所需的流速。关闭背景溶液的旋塞，启动示踪剂溶液的流动。同时，启动组分收集器。

继续让示踪剂溶液流动一段时间，以近似实现示踪剂的脉冲输入。建议在每小时1毫升的流速下，示踪剂溶液的脉冲持续时间为10分钟。在示踪剂溶液脉冲阶段结束时，停止示踪剂溶液泵的运行。

迅速关闭示踪剂溶液的旋塞，并以相同的流速开始背景溶液的流动。让背景溶液持续流动并收集组分，直至所有示踪剂完全通过系统并进入收集的组分中。在无菌条件下，将带有针头的塞子插入孔板培养物中，并将针头拔起。

塞子安装到位后，将针头降至灌注所需高度，因为出口针头的高度决定了液体的稳定液面。用公鲁尔帽封闭针头，并将整个培养板置于37摄氏度的培养箱中备用。准备用于灌注的两种培养基，将首先加入的培养基标记为一，另一种标记为二。

对于每种需要灌注的培养物，用培养基一装满一支注射器，其体积需足以维持整个灌注过程所需，并额外包含初始填充灌注系统所需的量；另用培养基二装满第二支注射器，其体积需足以维持整个灌注过程所需。将这两支注射器分别连接至一个三通旋塞阀的三个端口中的两个。

可能需要一段连接注射器与旋塞阀的管路。准备旋塞阀时，先关闭介质一的旋塞阀，将介质二注入旋塞阀中，直至液体开始从开口端滴出；然后关闭介质二的旋塞阀，将介质一注入旋塞阀中，直至所有残留的介质二均被冲洗出开口端。

使用母型到锥形鲁尔接头将上游管路连接至开放的旋塞端口。在管路的另一端插入公型到锥形鲁尔接头。从注射器中排出介质一，直至上游管路完全充满介质，然后按照之前所示方法继续准备下游管路。

将一个公头鲁尔接头插入下游管路的一端，并用母头鲁尔帽封闭。小心地将所有准备好的管路、注射器和培养板转移至将用于灌注的培养箱中。将注射泵和组分收集器放置在靠近培养箱的合适位置。

将注射泵放置在培养箱顶部或附近，并将组分收集器放置在靠近培养箱端口的位置。将注射器装入泵中。将所有上游和下游管路的带盖端捆扎在一起，从培养箱外部通过端口推入内部。

将下游管路的开口端插入馏分收集器多头分配器的分配移液管尖端中。在培养箱内，尽可能将上游管路的多余部分拉入培养箱，以增加流动培养基受热和吸收二氧化碳的管路长度。对于每个已堵塞的孔，迅速打开该孔的针头、上游管路和下游管路的帽盖，然后使用鲁尔接头将它们连接在一起。

所有部件连接完毕后，以相对较快的速度短暂运行注射泵，以确保所有流路正常流动。此时，若希望实验开始时下游管路已充满培养基，则继续运行泵直至所有管路充满，否则停止泵的运行。设定注射泵的培养基一流速以及组分收集频率，并同时启动两台设备以开始实验。

当需要更换培养基来源时，迅速停止培养基一的注射泵。关闭通向培养基一的旋塞阀，并启动培养基二的注射泵。如之后需要，可按同样方式将培养基来源切换回培养基一。

根据所需实验时长收集各馏分。通过两个停留时间分布（RTD）实验获得的馏分中示踪剂浓度被测定后，输入至基于数据的 MATLAB 脚本以生成两条 RTD 曲线。单根管道以及多段串联管路均能很好地拟合单一轴向分散模型；在线路中加入灌注式 48 孔板后引起的偏差可忽略不计，因此一米长管道的 RTD 以及整个系统的 RTD 均可用轴向分散函数进行拟合。

通过将轴向分散模型拟合到一米长管道的停留时间分布（RTD）数据，展示了一个模型拟合效果较差的示例，并将拟合结果与实验数据一同绘出。通过调整初始参数估计值，获得了良好的模型拟合结果，其中tau值约等于灌注系统体积除以其体积流量。将持续90分钟的TNF-α脉冲定义为系统的输入信号，并将其与一米长管路的RTD进行卷积，以确定在孔板入口处的TNF-α信号。

输入信号还与整个系统的停留时间分布（RTD）进行卷积，以确定收集组分中系统出口处的TNF-α信号。HEK 293细胞经基因工程改造，可分泌由含有NF-κB反应元件的启动子驱动的GLuc。实验结果显示，在TNF-α刺激后，由NF-κB驱动的GLuc表达显著升高，并随后缓慢下降。

该系统的不同变体在配套论文中有描述，包括一种更简单的装置，适用于无需输入信号以及使细胞暴露于药物-人连通性溶质谱的实验。