一种用于多孔板膜插件系统中三维组织模型渗透性和扩散性测定与模拟的方法

本实验方案的总体目标是在小型膜插件系统中测定3D皮肤模型的渗透性和扩散系数。这些参数有助于解答有关药物和化妆品应用中3D皮肤组织工程的关键问题，其中渗透性和扩散系数是至关重要的质量指标。该技术的主要优势在于，可在小型多孔插件中直接测量这些系数。

模拟中的小型膜插件系统可进一步改造，用于“器官芯片”装置及其他使用膜插件系统的应用。制备琼脂糖凝胶时，首先将 28.6 µL 新鲜配制的 80 °C 液态琼脂糖凝胶加入 96 孔膜插件系统的每一片膜上。10 分钟后，凝胶将完全凝固，可用于通透性检测。

为制备胶原细胞模型，首先在冰上将125 µL HBSS与1 mL胶原蛋白R溶液混合，随后用氢氧化钠中和。接着，向该混合物中加入125 µL悬浮于完全培养基中的原代成纤维细胞。然后将28.6 µL上述细胞悬液加入新的96孔膜插件系统的每个孔中。

在细胞培养箱中孵育30分钟后，在凝胶表面加入75微升完全培养基，并在每个孔底部加入300微升完全培养基，在细胞培养箱中过夜孵育。第二天，将培养基更换为75微升人成体低钙、高温角质形成细胞培养基，加入至每个胶原细胞模型中，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养三天。第四天，吸除细胞模型表面的培养基，并将培养板放回培养箱中继续孵育七天。

进行通透性实验时，将75微升供体物质加入小孔插入式模型系统的插入室中，并在每孔底部加入300微升受体物质。将该板置于37摄氏度、95%湿度、约480转/分钟的摇床中孵育5小时，每隔一小时将膜插入系统转移至一个新的空96孔板中，并使用酶标仪测量实验板底部孔中扩散的荧光信号。通透性实验结束后，打开相应的建模软件并创建一个新模型。

选择模型向导和三维模型。添加稀释物质的传递，然后点击研究。接着选择瞬态，点击完成。

在“全局定义”中，右键单击以添加参数，并将几何和物理参数输入到网格中。根据实验设置膜插件系统的几何结构，右键单击“定义”以添加两个域探针，将其中一个探针设置为受体域，另一个设置为供体域。将两个域均设置为取平均值，表达式为 C，单位为摩尔每立方米（mol/m³）。

在“传递性质1”和“稀释物质传递”中设置扩散系数。右键单击“稀释物质传递”以添加第二个传递性质2，并在域选择中选择第二个屏障。在“稀释物质传递”下的“初始值1”中，将浓度定义为零。

右键单击稀释物质的传输，添加第二个初始值 2，并选择供体作为第三个域。将浓度设置为荧光供体物质的初始浓度。右键单击稀释物质的传输，添加对称性 1，并选择所有构成完整几何体镜像的边界选中表面。

右键单击网格以添加两个自由四面体，并将第二个屏障设置为域。右键单击第一个自由四面体，将预定义网格的尺寸设置为超精细。在第二个自由四面体中，将受体和供体设置为域，并将预定义网格设置为更精细。

然后在研究一中，单击“计算”以启动模拟。为了将扩散系数拟合到扩散模拟生成的数据，请打开“添加物理”菜单并选择“数学”。找到“优化与敏感性”。

选择优化并点击添加到组件。然后右键单击定义以添加变量，并手动输入表三中的变量。接下来，在组件耦合菜单下，右键单击定义，添加平均值一，随后手动将受体添加为算子名称，并选择域一。

将实验数据导出到一个新的文本文件中。使用分号分隔数据列，使用换行符分隔数据行。右键单击优化选项，添加全局最小二乘目标，并将该文本文件链接到实验数据。

单击全局最小二乘目标，将第一列定义为时间列一，第二列定义为值列一。在值列的表达式中，输入变量 C。右键单击优化以添加全局控制变量一，并将 D_搜索声明为一个变量，其初始值为 1，下限为 0，上限为 1,000。

右键单击研究一以添加优化，并选择 SNOPT 作为优化求解方法。将最优性容差设置为十的负八次方。

然后将屏障上的扩散系数设置为 D。在研究设置中将模拟时间从 0 秒设置到 22,000 秒，时间间隔为 100 秒，然后单击计算以开始参数优化。胶原细胞模型的组织学分析显示，中央基质内的成纤维细胞有轻微染色。在胶原基质顶部，可见一层含有大量细胞核的结构，可能由人成体低钙、高温角质形成细胞组成。

使用荧光素钠盐和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖验证扩散物质分子大小的影响，结果表明，对于较小的分子尺寸，两种分子的模拟结果与实验数据均符合良好。然而，对于较大的分子尺寸，模拟曲线的走势出现较大偏差，表现为起始阶段的延迟以及后期曲线上升更为显著。事实上，随着分子尺寸的增大，渗透系数随之降低，且模拟得到的系数变化趋势与实验测得的渗透系数变化趋势相似。

值得注意的是，大多数使用人成体低钙、高温角质形成细胞的模型，其渗透性和扩散系数均低于不含人成体低钙、高温角质形成细胞的模型。胶原模拟模型可在11至12天内建立，若操作得当，渗透性测定可在6小时内完成。在操作过程中，保持温度、灌注体积、施加物质的浓度、湿度以及膜处理过程等边界条件恒定至关重要，以减少渗透系数的变异。

借助该模块化模拟，可减少实验工作量，并预测长期性能。该技术还可适用于其他渗透装置或器官芯片系统。该技术为药物和化妆品应用领域以及组织工程中相互作用开发的研究人员探索人工组织中的扩散渗透过程提供了新途径。