用于心脏药物安全性筛选的人工心脏组织自动收缩分析

该技术的总体目标是生成三维工程化心肌组织，可作为体外收缩分析平台用于药物筛选和疾病建模。该方法有助于回答心血管领域中的关键问题，例如疾病建模、安全性药理学以及基因变异或药物对收缩力的影响。该技术的主要优势在于，可在无菌条件下长期测量来自不同物种的工程化心肌组织的收缩力。

刚接触该方法的科研人员可能会因细胞质量不佳，或培养基中缺乏某种成分而遇到困难。因此，优化自身准备工作并避免反复循环至关重要。演示本实验操作的将是 Anika Benzin 和 Umber Saleem。

开始实验前，将1.6毫升温热的2%琼脂糖加入24孔板的辅助孔中，立即在琼脂糖中放入聚四氟乙烯垫片。室温下静置约10分钟后，琼脂糖变为不透明，表明其已凝固。

移除间隔物，并将PDMS支架放入铸模中，使每对支架柱插入琼脂糖模具内。当所有支架放置完毕后，将心肌细胞悬浮于培养基中，细胞浓度至少为每毫升1.5×10⁷个细胞，并加入新鲜配制的含纤维蛋白原的重构混合液，用移液管轻轻吹打10至15次，直至纤维蛋白原凝块完全溶解。检查移液管中的重构混合液是否均匀。

然后，对于每块工程化心肌组织（EHT），在200微升离心管中将100微升重悬液与3微升凝血酶混合。立即取100微升该EHT凝血酶混合液分装至琼脂糖槽中。每个EHT均需使用新的滤芯吸头。

当所有孔均加入重悬混合液后，盖上细胞培养皿的盖子，并在37摄氏度、7%二氧化碳条件下孵育2小时。孵育结束后，将培养板置于无菌操作台中，每孔加入200至500微升培养基。轻轻振荡培养板，然后将工程化心脏组织（EHT）放回培养箱中继续培养。

10 分钟后，小心地将支架转移至新的 24 孔板中，每孔加入 1.5 毫升 EHT 培养基，并将该板置于细胞培养箱中，在适当的培养条件下进行培养。每周一、三、五通过将 PDMS 支架转移至含新鲜培养基的第二块板中对 EHT 进行换液。浇铸后 7 至 10 天，EHT 应表现出自发性收缩，并使 PDMS 支架的支柱发生偏转。

为了分析EHT的收缩功能，在实验当天，应在测量前两小时开启EHT分析仪器中的加热装置。在分析开始前立即开启轴向系统的气体和电子供应。进行基线记录时，将EHT样品板放入EHT分析仪器中，并根据制造商的说明启动收缩分析软件。

根据软件使用手册的说明启动新运行，点击“方案”选项卡以输入相关研究信息。打开“设置”选项卡并选择用于分析的孔。由于时间限制，本视频仅演示两个工程化心脏组织（EHT）的分析过程。

然后点击相机视图选项卡，并启动相机的实时模式，启用自动图像检测功能。通过xyz坐标调整24孔板中每个选定孔的相机位置，确保每根EHT均位于窗口中央且处于对焦状态。确认蓝色十字标记位于EHT的顶端和底端，并能随EHT的收缩而同步移动。

然后按下位置确认按钮，以保存每个孔的设定位置。现在点击参数选项卡，定义软件识别收缩峰的条件，并用绿色方块标记峰。通过按下“将参数应用于所有孔”按钮，保存所有输入的设置。

然后点击自动选项卡和开始按钮，记录EHT的基础收缩，并计算每个EHT的自发性基础收缩力。实时收缩分析结果将在实时选项卡中显示。请确保蓝色十字仅在垂直方向移动，以匹配EHT的收缩情况。

为了分析某种特定药物对收缩的影响，首先将装有无蛋白甲状腺溶液的24孔板转移至无菌操作台，并将碳电极插入各孔中。将带有PDMS支架的工程化心肌组织（EHT）放置在电极上方，并将EHT放回培养箱。约半小时后，将EHT放入EHT分析仪器的联锁装置中，记录每块EHT 20秒的自发性基础收缩力。

接下来，将碳电极连接至起搏电缆，并开始对工程化心肌组织（EHT）进行电刺激。每个EHT记录10秒的起搏基线，确保所有EHT均被正确起搏。起搏信号现以蓝色垂直线标记，位于每次收缩峰之前的收缩图谱中。

基线记录完成后，将电极和PDMS支架转移至含有第一种药物浓度的新24孔板中，并立即将工程化心肌组织（EHT）放回EHT分析仪的联锁装置内，孵育20分钟。重新连接起搏电缆，调整图形识别，记录EHT在第一种药物浓度下的收缩反应。在所有药物浓度测试完毕后，保存所有生成的PDF记录文件，并逐一检查每份记录的图形识别情况，以及收缩峰方框和伪迹的位置是否正确。

对于离线分析，从运行数据库中点击选择相应运行的记录，在参数选项卡中更改收缩分析的参数。然后在离线选项卡中，选择离线分析以重新分析视频。调整图像识别并录制新的视频文件。

在实时选项卡中调整图像识别并选择样本复查。系统将根据新的位置分析EHT。每个EHT的分析均基于组织顶端和底端的图像识别。

随后，EHT收缩影像由EHT分析仪器的软件算法自动分析，并根据相关预设标准确定峰值。长期EHT收缩分析测量表明，在长达20小时内，收缩力、搏动频率、T1收缩时间或T2舒张时间均无明显的时间依赖性变化，表明该构建物具有高度稳定性。

事实上，每个信号EHT的结果均具有良好的可重复性，且变异程度较低。然而，暴露于hERG通道阻滞剂会导致T2弛豫时间显著延长，从一定浓度开始即出现该效应，并在较高浓度下出现不规则的搏动模式。

一旦掌握，若操作得当，可在30分钟内制备出24个EHT。该技术建立后，为疾病建模领域的研究人员探索基因变异在体外的影响开辟了道路。该模型具有多功能性，可与人类诱导性干细胞或基因组编辑技术相结合。

完成该操作步骤后，可进一步采用组织学、RNA和蛋白质分析等方法，以回答有关基因转录和表达的更多问题。观看本视频后，您应能够掌握工程化心脏组织的制备与分析方法。如果您对该操作流程有任何疑问，请随时直接与我们联系。