使用荧光寿命成像对衰老期间 C. Elegans 中的淀粉样蛋白结构进行表征

该方法使我们能够清晰地区分整合态的淀粉样蛋白结构与可溶性甚至聚集态的对应物。该技术以非侵入性方式在活体内进行，几乎无或仅有轻微的毒性副作用。由于其依赖于荧光团自身的荧光特性，因此在时间上具有高度的稳健性和可重复性。

荧光寿命成像显微技术（FLIM）已被应用于癌症诊断领域。然而，我们利用该技术研究与神经退行性疾病密切相关的蛋白质聚集的基本机制。该方法可应用于蛋白质聚集领域的研究。

只要与疾病相关的蛋白质被标记上荧光探针，就可以对其进行随时间的追踪和监测。能够促进或抑制聚集的化合物及策略均可被有效研究。任何可通过光学显微镜观察的生物系统，无论体内或体外，均适用于荧光寿命成像（FLIM），例如细胞培养、固定或通透处理的样品，以及任何必要的介质中。

在获取实验数据之前，务必在秀丽线虫体内测试所选荧光染料的特性，并在采集测量数据前验证实验装置完全正常运行。首先，在NGM平板上于20摄氏度条件下培养并维持线虫的生长。将线虫培养至生命第四天作为年轻成虫，第八天作为老年成虫。

成像当天，首先准备成像载玻片。将琼脂糖与重蒸水配制成3%（重量/体积）的溶液，放入微波炉中熔化，然后稍作冷却。

剪去1毫升移液枪吸头的尖端，吸取约200微升融化的琼脂糖。将琼脂糖滴加到一块干净的载玻片上，立即盖上另一块载玻片，注意避免产生气泡。让载玻片自然干燥，然后轻轻取下上层载玻片。

结果是获得一个具有均匀琼脂糖表面的载玻片，用于放置线虫。成像装置准备就绪后，在体视显微镜下操作，将10微升麻醉剂滴加到琼脂糖垫上，并轻轻转移5至10条线虫进入液滴中。使用睫毛尖将线虫分开。

将线虫紧密排列但不相互接触，以便在图像采集过程中更容易定位。小心地用盖玻片覆盖线虫。装片后一小时内进行测量。

确保线虫完全不动。打开FLIM采集软件。找到选项卡按钮并按下以启用输出。

将载有固定秀丽隐杆线虫（C.elegans）的载玻片置于载物台上，使用透射光模式下的10倍物镜，定位线虫在载玻片上的位置。取下载玻片，将物镜切换至63倍，并加入所需的浸油介质。将载玻片重新放回载物台，再次定位线虫。

开始扫描样品。选择感兴趣的区域，并聚焦于其最大投影平面。在FLIM软件界面上，预览检测到的光子数量。

ADC 值应在 1×10⁴ 到 1×10⁵ 之间。如有必要，可调整焦平面或增加激光功率以收集更多光子。需确保避免光子堆积，同时收集足够数量的光子，以获得良好的荧光寿命拟合与测量结果。

在菜单栏中，选择选项卡以设置采集参数。选择扫描同步输入，以实现单光子检测。将采集设置为固定时间或固定光子数量。

按下开始以启动采集。打开软件，通过文件菜单加载FLIM数据文件。即使来自不同的实验批次和不同的生物学重复，也需加载同一条件下所有样本的数据。

如有需要，可通过分割工具和分割管理器对多个FLIM图像中的线虫信号进行分割。拖动裁剪工具围绕目标区域，直至该区域被高亮显示。完成后，点击“确定”。选择秀丽隐杆线虫（C.elegans）强度图像中的一个较小区域。

该区域的衰减曲线显示在界面右侧的大衰减窗口中。为了外推寿命，在数据选项卡中，设置一个介于40到300之间的任意积分最小值，以排除过于昏暗而无法获得良好拟合的像素。选择时间最小值和时间最大值，将FLIM信号限制在这些数值范围内。

请勿更改预设的单个光子计数。输入采集过程中所用激光器的重复频率，单位为兆赫兹。输入门控最大值，以排除所有饱和像素。

在“寿命”选项卡中，选择要使用的全局拟合方式。除非已知所选的荧光衰减为多指数衰减并表现出多个寿命，否则请勿更改除指数个数选择之外的任何其他参数。通过IRF菜单上传仪器响应函数（IRF）。

为了估算IRF偏移，选择IRF，然后估算IRF偏移。一组数值将自动显示在IRF选项卡上。一旦确定，不要再更改该选项卡上的任何其他参数。

所有参数设置完毕后，点击“拟合数据集”。结果拟合以蓝色线条高亮显示，应与所有事件重叠。当所有事件均沿拟合线对齐时，即获得良好拟合。

单击软件界面右上角菜单中的“参数”选项卡，选择统计、加权平均值，并确保卡方值尽可能接近1。所选图像的寿命值因此显示为tau1。通过文件、导出强度图像、拟合结果表格、图像、直方图导出任何感兴趣的信息。

此处展示了秀丽隐杆线虫（C.elegans）在生命第四天或第八天表达肌肉组织中Q40 RFP的代表性图像。IQ85品系中更长的Q序列更容易发生聚集，在生命第四天的直方图中已表现出荧光寿命的偏移。事实上，在第四天时，IQ85已可观察到焦点形成，而IQ44中则尚未出现。

然而，IQ44在老化过程中也表现出焦点形成，因而荧光寿命降低。最后，在NQ40CFP菌株中未检测到焦点形成，荧光寿命亦未减少。对于该菌株，老化过程中平均荧光寿命仅有轻微且无统计学意义的变化。

一旦建立线虫模型，收集到的光子数量对于获得良好的寿命拟合至关重要。该方法还可与其他技术结合使用，例如荧光共振能量转移（FRET）、光漂白后荧光恢复（FRAP）或相关测量技术。所有这些改进方法均可提供有关被研究蛋白质及其聚集体性质的额外信息。

在蛋白质聚集和蛋白质稳态研究领域，该技术可用于研究施加于系统中的任何扰动、不同蛋白质组分的分布情况，以及蛋白质在活体生物中的转运过程，特别是可溶性与不可溶性蛋白质组分之间的差异及其生物学意义。麻醉剂叠氮化钠具有毒性，操作时应佩戴手套和护目镜，并在通风橱中进行稀释。由于该技术基于显微镜成像，因此必须严格遵守与激光操作相关的所有安全警示事项。