小分子微晶电子衍射

在此实验流程中，我们展示了如何在数分钟内将小分子粉末转化为三维结构。该技术对化学领域具有变革性意义。许多化合物难以生长成大尺寸晶体。

利用微晶电子衍射（MicroED），我们能够从纳米级晶体中解析出原子分辨率的结构。本次演示由加州大学洛杉矶分校（UCLA）教授 Mike Martynowycz 博士进行。首先，将少量粉末、液体或固体转移至小瓶或试管中。

对于已呈粉末状的样品，用盖子将管子密封，直至需要使用该样品。同样，将液体样品干燥成粉末。用塑料膜包裹玻璃盖玻片的一端。

将透射电镜载网放置在盖玻片上表面的膜上，使带有棕色碳膜的一面朝上。然后将带有载网的盖玻片放入辉光放电仪腔室中，使用负极设置在15皮安电流下进行约30秒的辉光放电处理。在向载网添加样品前，将其连同盖玻片一起存放在内衬滤纸的玻璃培养皿中。

用镊子从带盖的培养皿中取出经辉光放电处理的透射电镜载网，将其放置在圆形滤纸上，碳膜面朝上。使用小刮勺取极少量粉末，将其置于滤纸上透射电镜载网旁的一小块方形玻璃盖玻片上。再取另一小块方形玻璃片或盖玻片覆盖在粉末上方。

用手指轻轻将两张载玻片相互摩擦，以产生细粉。将盖玻片倾斜并置于滤纸上的电镜载网（TEM grid）上方，继续在距离经辉光放电处理的电镜载网上方几厘米处摩擦盖玻片。观察粉末是否向载网方向下落。

通过移除两片玻璃盖玻片中的一片，暴露出研磨成细粉的样品。然后使用一片滤纸，轻轻地将盖玻片上的细粉刷到透射电镜（TEM）载网上。用一对镊子夹住TEM载网的边缘，确保镊子尖端不会刺穿任何网格方格。

将网格抬高至滤纸上方一到两厘米处，并将网格倾斜至与下方滤纸呈90度角。在保持网格被镊子牢固夹持的同时，轻轻敲击镊子，以去除任何松散的粉末。用手将夹有网格的镊子尖端直接插入液氮容器中，对网格进行速冻，并等待直至网格和镊子不再产生沸腾现象。

在液氮条件下，将载网放入样品 holder 中，使碳膜面朝向样品，确保电子束先照射样品，再穿过碳支持膜。将样品 holder 装入透射电子显微镜（TEM）时，须始终保持载网处于液氮温度。对于自动进样系统，应将夹好的载网置于液氮冷却容器内的样品盒中，以便自动进样机械装置接收样品盒，同时确保样品在自动进样器与镜筒之间转移过程中保持安全低温状态。

打开透射电镜镜筒阀门，使用手控面板将放大倍数调节至尽可能低的水平。调节手控面板上的亮度旋钮，使荧光屏上出现一个圆形明亮区域以找到电子束。在采集高分辨率MicroED数据之前，使用适当的软件在低倍率下拍摄完整的载网图谱，并确保透射电镜在低倍和高倍成像条件下均已良好校准。

在薄膜上找出无破损碳膜且无可见黑色或深色颗粒的网格方格。通过手控面板上的操纵杆进行物理移动，或通过采集的图谱进行虚拟导航，查找未破损并含有微晶的网格方格。将每个此类方格的中心位置添加至待检测的网格位置列表中，该列表可在显微镜用户界面或显微镜自动化软件中的笔记本中进行记录。

将放大倍数设置在500至1300倍之间。在每个存储的网格位置调整同心高度，并将保存的z值更新为记录的位置。在荧光屏或平板相机上寻找网格上的微小黑色斑点或颗粒。

良好的样品在高倍率下通常具有清晰的边缘，表明晶体排列有序。将找到的潜在晶体移至屏幕中央，并增加放大倍数，使透射电子显微镜进入高倍模式。插入选区光阑，并调整光阑至更大或更小尺寸，以确保所选区域大于晶体范围。

通过按下透射电镜手控面板上的衍射按钮，切换至衍射模式，并确保荧光屏已插入。使用放大倍数调节旋钮调整相机长度，使边缘分辨率至少达到一埃。调节衍射焦距，使中心斑点尽可能锐利且细小。

使用衍射偏移旋钮，将中心光束移至荧光屏的中心位置。插入光束挡板，并确保光束位于其后方。抬起荧光屏，并用相机进行短时间曝光。

检查相应的衍射图样，确保图样具有清晰且规则排列成行和列的衍射点。将晶体坐标保存在透射电子显微镜（TEM）用户界面中，或通过手写记录下来，然后对当前网格方格内所有感兴趣的潜在晶体重复进行衍射筛选。在放大倍数高于1000倍的条件下将已筛选的晶体置于视野中心，并使用自动程序或手动方式调节晶体的中心高度。

插入最适合晶体尺寸和形状的选区光阑。将载物台向正负方向倾斜，直至图像被网格条纹遮挡。并通过现代相机的滚动快门读出模式每秒读取一次数据，记录下这些角度，以用于数据采集。

在显微镜用户界面或专用软件中，通过设定最大倾斜速度的百分比来确定旋转速率，并指定停止时机。将数据保存为多种格式，包括单帧图像或图像堆栈。以晶体学格式采集的微晶衍射视频展示了来自透射电镜载网上的卡马西平微晶的连续旋转MicroED数据集。

在数据收集、整合和结构解析之后，可确定高分辨率结构，其清晰度取决于数据的质量和完整性。将样品施加到载网上对于获取高质量数据至关重要。按照本方法操作后，可使用标准晶体学软件对数据进行进一步处理。

证明微晶电子衍射（MicroED）是一种适用于小分子的强大方法，已在全球范围内推动了其在解析关键重要分子新结构中的应用。