微型生物反应器阵列（MBRA）组装与使用的更新方案

因此，我们的研究聚焦于肠道微生物组，特别是如何通过工程化手段阻止有害病原体的定植。同时，我们也致力于揭示这种定植抵抗背后的生态学规律与作用机制。诸如高通量测序、先进生物信息学、无菌小鼠以及体外肠道模型等技术，正在彻底改变我们研究微生物群落及其在健康与疾病中作用的方式。

体外肠道模型面临的主要挑战之一是难以实现高通量运行。我们需要的是能够大规模功能性研究微生物群落的系统。微型生物反应器阵列是一种连续流动培养系统，旨在解决其他系统在通量能力方面的不足。

它使我们能够在扩大实验规模的同时，仍然捕捉到复杂且可重复的微生物群落行为。首先，确保迷你生物反应器阵列条带已通过3D打印制备，并包含六个独立的生物反应器腔室。准备好组装所需的所有组件。

使用1/4英寸28 NF细牙丝锥和T型手柄丝锥扳手，对每个腔室中的三个1/4英寸接口进行攻丝，以便安装接头。用水清洗腔室后，将一根10毫米×3毫米的磁力搅拌子放入每个腔室中，并加入1毫升蒸馏水。

然后在生物反应器的每个端口上方放置一个橡胶垫圈。对于每个腔室，将一根带螺纹的公接头进液管、一根带螺纹的公接头废液管和一根空的带螺纹的公接头分别拧入端口中。现在将六个橡胶隔垫插入3/32英寸母接头刺针上，并将每个隔垫的上部护套向下翻折，覆盖住颈部。

将这些连接到每个腔室的指定端口。按所需长度和数量裁剪C型弹性管。在每段管的一端连接一个1/8英寸的雌性卡扣接头，另一端连接一个雄性锁紧接头。

然后将1/16英寸的雌性接头宝塔头插入内径为1.14毫米的红色双止位E-lab管两端，以及内径为0.89毫米的橙色双止位E-lab管两端。将准备好的E-lab管连接至C-flex管，并确保六段C-flex管的每一段均通过雌性接头宝塔头分别连接一条红色和一条橙色E-lab管。接下来，根据需要将C-flex管剪成不同的长度。

将1/8英寸雌性卡扣接头和雄性卡扣锁紧接头分别连接到一段3英寸和一段12英寸C-flex管的两端。将雄性卡扣锁紧接头连接到其余管段的两端。按照三维示意图组装废液管路分支结构。

根据C-flex管的长度，按升序将红色双止动E-lab管的裸露端连接到废液管路树上的终端雄性卡扣锁。然后将3英寸的C-flex管与1/8英寸雌性卡扣接头和雄性卡扣锁连接器连接至废液管路树的顶部。按照三维图示组装进液管路树。

根据C-flex管的长度，按升序将橙色双止动E-lab管的暴露端连接到进液管路树的末端雄性接头上，并将12英寸的C-flex管连接到进液管路树的顶部。将进液管路树末端的可变长度C-flex管按从左至右由短到长的升序连接至生物反应器。将废液管路树末端的可变长度C-flex管按从左至右由长到短的降序连接至生物反应器条带，以适应泵的放置。

将左侧条带上的所有C-flex进液管捆绑在一起，并用扭结扎带固定。在C-flex管路之间用橙色双止动E-lab管形成一个环，使用 autoclave 胶带固定该环；在生物反应器条带的废液侧，对红色双止动E-lab管重复此操作。用铝箔覆盖进液和废液管路末端的雌性接头，以防止污染。

松开每个生物反应器腔室上带有隔垫的雄性螺纹诱饵，以便在高压灭菌过程中让蒸汽逸出。将组件放入高压灭菌筐后，将进料管路和废液管路的分支分别拉伸至盛有MBRA条的容器旁边的其他筐中。为将系统连接至泵，请移除固定废液和进料管路E型实验室管路的高压灭菌胶带，并解开C型柔性管路的捆扎。

将 MBRA 置于搅拌板顶部的两个泵之间，使用 3D 打印支架将其固定，并与板上的标记搅拌位置对齐。现在将进样管路 E-lab 管连接到蠕动泵的泵头，并将管路挡块插入泵头插槽中。

对位于搅拌器右侧泵上的废液管路E-lab管重复上述操作。然后将蠕动泵泵头卡入泵中。使用3D打印的管路固定架整齐排列C-flex管路。

将废液管路分支的末端连接至与废液瓶相连的管路。接着，将进液管入口端的雌性接头连接至培养基瓶盖上12英寸长管的雄性接头。启动两台泵以开始培养基流动，并确保当废液侧位于泵的右侧时，两台泵均设置为顺时针旋转方向。

观察每个生物反应器腔室中的液滴大小和滴速。如果发现任何变异或异常，应更换与该腔室相连的橙色双止动E-lab管路，以减少流速差异。待所有腔室充满后，关闭两台泵，并让生物反应器静置24至48小时，以检查是否存在污染，然后再开始实验。

将培养基输入切换至含有1升去离子水中10%次氯酸钠溶液的容器，并将两台泵的流速调至最大，以用次氯酸钠溶液置换生物反应器腔室中的内容物。当腔室中的培养基完全被置换后，将MBRA倒置，使液面以上部分浸没在消毒液中消毒5分钟。5分钟后，将系统恢复至正常位置，再等待额外5分钟以完成灭菌。

在清除培养基并消毒培养室10分钟后，将次氯酸钠溶液替换为一升去离子水，并冲洗系统直至水流完全通过。然后断开生物反应器E-lab管路与泵的连接，并取出膜生物反应器组件（MBRAs）。从生物反应器上取下已使用的隔膜，并排空各腔室，直至每个腔室仅剩一毫升水。

更换隔垫、橙色双止动 E-lab 管，并按照之前演示的方法对完全组装好的条带进行高压灭菌。重复使用三个循环后，执行以下步骤。一份人类粪便样本已在 MBRA 系统中制备并培养。

经过四天的连续流动后，所有九个生物反应器中的微生物群落均由18个细菌属主导，每个属在任一重复样本中的相对丰度均至少达到2%。在检测到的65个属中，有22个存在于全部九个生物反应器重复样本中，表明具有高度可重复性。Alpha多样性分析显示，在观测到的操作分类单元数和香农多样性指数方面，重复样本之间的差异极小。