高效分化人多能干细胞为肝细胞

该方法能够高效地生成大量高纯度的人类肝芽祖细胞和肝细胞样细胞。生成这些肝细胞的能力可能对再生医学及其他领域具有重要意义。通过调控发育信号通路，促进肝脏分化并抑制非目标细胞类型的形成，该方法可在分化第6天和第18天分别高效获得人类肝芽祖细胞和肝细胞样细胞。

该技术的主要优势在于所获得的人类肝细胞具有高纯度。开始此操作时，向含有搅拌子的锥形瓶中加入 50 毫升 IMDM 培养基。将培养基加热至 50 摄氏度，并在持续搅拌的同时加入 0.5 克 PVA，以配制浓度为 10 毫克/毫升的 PVA 储存液。

此后，将 PVA 溶液从加热垫上取下，静置冷却至室温。待溶液冷却后，通过无菌的 0.2 微米滤膜进行过滤。根据文本方案中表一的说明，将过滤后的 PVA 与其他试剂混合，配制 CDM2 和 CDM3。

使用无菌的0.2微米滤器过滤所有培养基。然后，按照文本方案中表一的说明配制剩余的基础培养基CDM4和CDM5。配制分化培养基时，首先将冻存的小分子和/或生长因子在室温下解冻。

分装所需体积的基础培养基，并按指定浓度向其中加入相应的小分子化合物和生长因子。使用前一天，在4°C条件下解冻基质。次日，将500微升基质加入50毫升冷的DMEM中，按1:100的比例稀释基质。

用移液器将稀释后的基质溶液加入所需数量的孔中，加入的体积以刚好覆盖孔表面为宜。将包被基质的培养板转移至37摄氏度的培养箱中孵育至少60分钟。在接种细胞前，立即吸除包被孔中残留的基质溶液。

然后，吸出接近完全汇合的hPSC培养板中的培养基，加入市售的解离试剂，注意用量只需覆盖细胞生长的表面即可。将hPSC在37°C下用解离试剂孵育5分钟，或直至部分细胞集落开始脱落。接着，加入DMEM/F-12培养基以稀释解离试剂。

使用5 mL血清移液管轻柔地反复吹打多次，以将所有细胞从孔表面冲洗下来。将重悬的单细胞收集至50 mL锥形管中，并根据需要使用DMEM和F-12培养基稀释。将收集的hPSCs在4°C下以350 × g离心3分钟，以沉淀细胞。

在等待离心过程中，吸除将要接种hPSCs的培养板中的基质。向目的孔中加入足量的mTeSR培养基以覆盖孔底。离心完成后，小心吸除上清液，保留锥形管底部的hPSC沉淀细胞。

将细胞沉淀重悬于添加了1 µM商业化购得的Thiazovivin的mTeSR培养基中。使用P1000移液器轻轻吹打2至3次，使细胞沉淀均匀重悬，形成单细胞悬液。立即吸取10 µL细胞悬液至血细胞计数板中，计数细胞数量。

用添加了Thiazovivin的mTeSR培养基调整重悬的hPSC体积，以达到铺板所需的细胞浓度。然后，以十字交叉方式轻轻摇动培养板数次，确保细胞均匀分布。hPSC铺板至少24小时后，使用相差显微镜检查细胞形态，重点关注铺板后hPSC集落的直径。

接下来，按照文本方案中表二的说明配制第一天APS分化培养基。接种后一天，吸除添加了Thiazovivin的mTeSR培养基，并用IMDM培养基短暂洗涤已接种的hPSCs。随后，向hPSCs中加入第一天培养基。

记录细胞放回37摄氏度培养箱的时间和位置。按照分化过程中的相应日期，在每天大致相同的时间，配制所需的分化培养基并添加至细胞中，继续后续的分化步骤。本研究中，由人多能干细胞（hPSCs）生成了富集的肝芽祖细胞群体，并进一步分化为肝细胞样细胞。

分化第二天，原条细胞已分化为定型内胚层细胞。这些细胞绝大多数表达 SOX17 和 FOXA2。分化第三天，内胚层细胞进一步分化为前肠前体细胞，呈多边形形态。

随后，在第6天，前肠前体细胞已分化为肝芽前体细胞。这些肝芽前体细胞表达AFP、TPX3和HNF4alpha。在三种hPSC细胞系中，该方法可在第6天以约89%的效率生成AFP阳性的肝前体细胞。最后，在hPSCs向肝细胞分化18天后，出现白蛋白阳性的类肝细胞。

形态学上，这些细胞呈上皮样，形成类似胆小管的明亮边界。在此阶段，第18天人多能干细胞来源的肝细胞的细胞质颜色较细胞核更深。在接种人多能干细胞以进行分化时，必须以适当的密度接种，并通过轻轻摇动培养板使细胞均匀分布于孔内。

在体外生成人肝细胞的能力是一项关键技术，将使科学家能够研究肝脏发育的相关机制。该方法可在体外大量生成人肝细胞，可用于研究肝脏功能与疾病，并最终为肝功能衰竭提供新的治疗手段。