ExCYT：用于简化高维细胞术数据分析的图形用户界面

该方法有助于解答生物医学领域的关键问题，例如理解具有生物学意义的亚群表型。此技术的主要优势在于，即使没有编程经验的人员，也能使用最新的高维分析技术来分析其细胞计量数据。要开始分析流程，首先选择细胞计量的类型，以及从文件中采样的事件数量。

接下来，单击“门控群体”（Gate Population），选择感兴趣的细胞群体，并输入用于下游分析的事件百分比。然后在列表框中选择用于分析的通道数量。对于t分布随机邻域嵌入（T-distributed Stochastic Neighbor Embedding，t-SNE）分析，单击t-SNE以开始计算降维后的数据集。

当计算完成后，点击“保存 t-SNE 图像”，然后在“标记物特异性 t-SNE”弹出菜单中选择一个特定的目标标记物。将显示一幅图，展示 t-SNE 图的热图表示，可用于保存以生成图表。要开始聚类分析，请在“聚类方法”列表框中选择一种选项，然后点击“聚类”。

若要按感兴趣的标记物对聚类进行排序，请从“排序”下拉菜单中选择相应的选项，然后单击“升序”或“降序”，以更新“聚类”列表框中的聚类列表。若要为特定通道上的某个聚类设置最小阈值，请从“阈值”下拉菜单中选择一个选项，并设置适当的阈值。设置阈值后，单击“添加高于阈值”或“添加低于阈值”以指定阈值方向，并在“聚类筛选”面板的“聚类频率阈值”框中输入数值截断点，以设定聚类频率的最小阈值。

若要选择簇以进行进一步的个性化分析，请在“簇”列表框中选择感兴趣的簇，然后使用“选择”按钮将所选项移至“簇分析”列表框中。若要创建簇的热图，请在“簇分析”列表框中选择感兴趣的簇，然后单击“簇的热图”按钮。

要创建高维箱线图或高维流式图，请在“Cluster Analyze”列表框中选择感兴趣的聚类，然后单击“High-Dimensional Box Plot”或“High-Dimensional Flow Plot”，以直观评估各个聚类中特定通道在所有维度上的分布情况。要在传统的二维流式图中显示聚类，请在“Conventional Flow Plot”面板中选择适当的转换方式和通道，然后单击“Conventional Flow Plot”。此处展示了一个髓系分析流程中针对多种标志物的代表性t-SNE热图分析结果。

使用 ExCYT 中的快速贪婪算法对 100,000 个最近邻数据进行聚类，共揭示出 19 个细胞亚群。将原始热图与 ExCYT 生成的聚类结果进行比较，可在两组数据之间识别出相似的髓系细胞聚类。对淋巴细胞谱系 panel 采用更传统且更快速的层次聚类方法进行分析，通过 t-SNE 热图也得到了相似的标志物分布结果。

此外，通过层次聚类对数据进行聚类分析，显示出相似的淋巴细胞簇。值得注意的是，还通过高维流式图鉴定出一种独特的调节性T细胞群体。为了快速且定量地评估各标志物之间的共表达关联，首先采用硬K均值聚类算法在二维t-SNE数据上划分出5000个聚类。

随后利用所有聚类中所有标记物的中位表达水平，基于这些聚类生成热图，以便于识别共表达关联，例如 Tim-3、PD-1、CD38 和 4-1BB 的共表达关系。在执行该流程时，重要的是要尝试探索不同的参数设置，例如不同的聚类方法，以全面深入地分析所研究的数据。