利用 Cytofast 与上游聚类方法 FlowSOM 和 Cytosplore 对高维细胞流式数据进行可视化与定量分析

质谱流式细胞术产生的数据十分复杂，需要以高效且简洁的方式进行可视化。Cytofast 是一种能够突出免疫细胞群体内免疫学模式的方法，并可确定与临床治疗或实验分组相关的细胞亚群。在使用 FlowSOM 或 Cytosplore 等任何聚类方法之后，均可应用 Cytofast 进行分析。

该方法将帮助您发现与临床治疗或实验分组相关的特定细胞亚群。通过此方法，您能够以定量的方式快速获得数据的免疫学整体概览。首先，使用 Cytosplore 或 FlowSOM 进行聚类分析。

如果使用 Cytosplore，请点击“文件”并打开 FCS 文件以上传 FCS 文件。随后，当系统提示时选择一个共因子用于双曲反正弦（Hyperbolic ArcSinh）转换，并点击将唯一样本标签作为通道添加。选择运行 HSNE 以执行三级 HSNE 分析，并等待图谱生成。

在第一个HSNE层级中，通过选择CD161阳性细胞并右键单击以放大选中区域，检查CD161阳性的细胞。在第二层级中，重复该操作，进入仅包含CD161阳性事件的第三层级。当最后一个t-SNE图生成后，通过右键单击该图并选择“保存聚类”，将Cytosplore定义的聚类保存下来。

按照 Cytosplore 的提示选择输出文件的目录，并记录此位置，因为后续将使用该路径将 FSC 文件加载到 R 中。重命名输出文件时仅使用简单字符，以便于识别和后续处理，然后选择保存。使用指定函数 readcytosploreFCS 将文件加载到 R 中。为清理数据，通过检查与无关参数对应的列位置，从矩阵中移除时间、背景等部分参数。

接下来，重新排列标记，使谱系标记优先显示，随后显示功能标记。通过上传包含临床信息的电子表格元文件，将元数据文件与 Cytosplore 生成的数据进行关联。为了使用 FlowSOM 进行聚类分析，需在 R 中使用 read 函数加载先前对 CD161 阳性事件进行设门的原始数据。

使用 flowSet 函数。通过选择适当的列并以 ArcSinh5 方式对数据进行转换，从而选择相关的生物标志物。在函数中选择 cofactor=5，应用五的辅助因子。

使用 FlowSOM 函数对数据进行聚类，并通过将数据聚类为 10 个子集（与之前 Cytosplore 输出的结果相同）来比较 FlowSOM 和 Cytosplore。然后将每个细胞分配至其对应的子集和样本 ID。在 R 中加载包含分组信息的元数据文件，并使用文稿中的代码将其与 FCS 文件关联。基于 FlowSOM 得到的数据框创建 CF 列表。

然后重新排列标记，使其排列方式与 Cytosplore 分析的输出结果相似。在生成热图之前，使用 cellCount 函数按样本生成计数表。由于某些聚类包含的细胞数量少于其他聚类，因此在函数中指定 scale=true 以对每个聚类的数据进行标准化，从而便于观察样本间的分布情况。

使用热图可视化数据，然后通过生成细胞计数但不对数据进行标准化以获得每个簇的频率，进而绘制箱线图。最后，通过记录 CD45、CD11c 和 CD54 标记物的名称并将其包含在 MSI 图函数中，可视化这些标记物的表达强度。Cytofast 会生成多种可能的输出结果，包括基于标记物表达情况分析中识别出的所有簇的热图。

顶部的树状图表示已鉴定出的聚类之间的层次相似性。上方面板显示了另一个热图，展示每个样本中相应亚群的相对数量。同时，右侧的树状图基于亚群频率显示了样本之间的相似性，表明自然杀伤细胞的表型在注射后三天受到 PD-L1 治疗的影响。

可以获取 FlowSOM 结合 Cytofast 以及 Cytosplore 结合 Cytofast 的综合热图。Cytofast 还可用于对数据进行定量展示，并以箱形图显示结果。Cytofast 软件包中包含的另一项功能是 MSI 图，可显示每组中每个标记物的中位信号强度图。

该功能可用于检测整体性变化，例如在PD-L1处理组的自然杀伤细胞中CD54或CD11c表达水平的升高。该技术是一种快速可视化和定量数据的方法，可用于发现治疗后新的细胞反应。在此方法之后，可使用R语言中的global test软件包来检验一组协变量是否与响应变量存在关联。

这将显示每个亚群与临床结果之间的相关性。