利用Histoflow细胞术生成与分析高参数组织学图像

我们的总体目标是研究免疫系统细胞以及中枢神经系统内的胶质细胞如何参与多发性硬化等神经系统疾病的发病与进展过程。免疫荧光显微技术是生物学各个领域中一种标准且广泛应用的技术，对神经科学和免疫学研究至关重要。困扰研究人员的主要问题之一是，由于传统显微镜的局限性，免疫荧光显微技术通常在同一时间可成像的探针数量有限。

在本实验方案中，我们描述了一种可增加多种显微镜单次成像探针数量的方法，并提供了一套用于处理信息密集型图像的分析流程。本方案的优势在于，其可适配多种广泛使用的显微镜，且操作简便，从而使更多实验室能够开展多重组织学分析。首先，设置荧光显微镜以进行成像。

插入一张带有免疫染色组织切片的完全染色玻片。设定物镜后，按下实时按钮，然后对样本进行聚焦。使用自动缩放图标评估各通道的信号是否充分饱和。

完成显微镜设置后，将单色对照样品载入显微镜。先将焦距调至样品下方，然后在Zs层叠菜单中点击“开始”选项，以开始设置Z层叠；接着将焦距调至样品上方，再点击“结束”选项。

为了对图像进行荧光补偿，打开一张单染对照图像。观察每个通道的灰度窗口中是否存在非目标通道的信号。为消除串色，手动在矩阵中输入数值，然后点击应用，以检测串色是否已被充分去除。

接下来，将每个对照的所有数值汇总成一个单一矩阵。将该矩阵应用于完全染色的样本。启动 ilastik 软件，并打开组织的 TIFF 文件。

单击训练标签，然后使用画笔工具在图像上标出单个细胞。确保标注时包含细胞内部和细胞膜。接下来，使用标签二标注所有非目标细胞的区域。

现在启动软件三，打开包含所有荧光染料的组织 IMS 图像。选择“核掩膜”选项作为核检测的源通道，然后选择通过种子点分割核的高级选项。设置核直径的数值。

检查图像中是否存在融合的多个细胞或缺失的细胞。然后单击已创建的细胞对象，接着进入创建选项卡，再选择“存储批量参数”选项以保存使用设置。启动 Anaconda，然后在 Anaconda 中启动 Jupyter Lab。

打开补充代码文件一，然后在运行菜单中点击运行全部单元格或运行选定单元格。当提示出现时，输入导出的荧光值文件所在目录。然后输入用于保存处理后文件的任意合适位置的目录。

运行代码的下一部分，使用每个通道的名称对数据进行标注。建立设门策略后，在菜单中右键单击细胞群，然后选择导出。将参数连同标题一并导出为 CSV 文件。

再次在 Anaconda 中启动 Jupyter Lab，然后打开补充编码文件二中的脚本并运行代码。当提示输入 software four 文件的位置时，输入导出的 CSV 文件所在的文件目录。

接下来，当系统提示添加输出位置时，选择一个所需的文件目录，并确保该文件目录在末尾包含文件名。运行余下的代码。现在将文本复制到一个 txt 文件中，并在软件三中打开相应的 IMS 文件。

单击文件中的目标对象。切换到统计选项卡，然后将文本粘贴到搜索栏中并开始搜索。所有感兴趣的细胞现在都将被高亮显示。

在使用多种染料染色的组织中，光谱重叠的荧光染料得到了有效分离。染料的分离清晰地区分了淋巴组织中的不同细胞类型。即使细胞紧密聚集，用户自定义的机器学习方法也可用于实现细胞的分离。