哺乳动物mRNA上翻译起始复合物形成的脚印分析

本趾印分析的总体目标是观察翻译起始复合物在哺乳动物 mRNA 上的形成。该方法有助于解答 mRNA 翻译领域的关键问题，例如由 IRES 介导的翻译起始。该技术的主要优势在于能够对特定 mRNA 上的翻译起始复合物形成进行详细分析。

组装转录反应体系，以PCR扩增的DNA模板为模板转录XIAP IRES RNA或其突变体RNA。随后，向每20微升RNA反应体系中加入2单位无RNase的DNase，以去除DNA模板。37摄氏度孵育30分钟。

然后，用无核酸酶的水将经DNase处理的RNA稀释至终体积为110 µL。接着，加入110 µL酸性酚以开始RNA纯化。将样品涡旋振荡5秒，并在室温下以20,000 × g离心3分钟。

在进行苯酚抽提前，必须将RNA或cDNA进行稀释。如果体积过小，则难以有效地回收水相，最终得率会很低。然后，小心地将含有RNA的水相100微升转移至新的微量离心管中。

加入10 µL 3 M乙酸钠（pH 5.5），混匀样品。然后加入三倍体积的100%乙醇以沉淀RNA，涡旋混匀样品5秒。在20 °C下孵育过夜。

第二天，在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心 30 分钟，弃去上清液。随后用 500 微升预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，并重复离心步骤。小心吸除尽可能多的上清液，注意不要扰动沉淀。

然后将沉淀在空气中干燥5到10分钟。用无核酸酶的水重悬沉淀，使其终浓度为0.5微克/微升。开始进行趾印分析时，向每个1.5毫升微量离心管中加入15微升未经核酸酶处理的兔网织红细胞裂解液，这些管中分别含有野生型XIAP IRES RNA及其突变体。

向每支试管中加入RNase抑制剂、ATP和GMP-PNP。在30摄氏度下孵育5分钟。随后，向每支试管中加入1微升相应的RNA，并在30摄氏度下继续孵育5分钟。

在孵育期间，将DTT和亚精胺加入到引物延伸阻滞缓冲液中。然后，向每个离心管中加入22微升引物延伸阻滞缓冲液，在30摄氏度孵育3分钟。接着，加入0.5微升IR荧光标记的引物延伸阻滞引物，将反应体系置于冰上孵育10分钟。

随后，加入 2 µL dNTPs、2 µL 醋酸镁和 1 µL 禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶。用 toeprinting 缓冲液将终体积调至 50 µL。然后，在 30 °C 下孵育 45 分钟，进行引物延伸。

向趾印反应中加入乙酸镁也至关重要，否则逆转录酶无法发挥最佳功能。随后加入 200 微升无核酸酶水。加入 250 微升 25:24:1 酚:氯仿:异戊醇（pH 8.0），以开始 cDNA 的纯化。

将样品涡旋振荡5秒后，在室温下以20,000 × g离心3分钟。随后，小心地将含有DNA的水相转移至新的微量离心管中。然后加入三倍体积的100%乙醇以沉淀DNA，并涡旋振荡5秒。

在20摄氏度下孵育过夜。第二天，在4摄氏度下以20,000 × g离心30分钟，弃去上清液。随后，用500微升预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，在4摄氏度下以20,000 × g离心15分钟。

尽可能吸除上清液，注意不要扰动沉淀。然后将沉淀在空气中干燥5到10分钟。将DNA沉淀溶解于6 µL无核酸酶的水中。

然后，加入3 µL甲酰胺上样染料。使用测序试剂盒，以toeprinting引物和编码XIAP IRES RNA的DNA构建体来制备双脱氧核苷酸测序梯度。随后，将每种测序反应的6 µL与3 µL甲酰胺上样染料混合。

清洗并组装好胶板后，倒入凝胶并插入梳子。待凝胶聚合完成后，组装测序装置，并向槽内加入1× TBE缓冲液。随后在1500伏电压下预电泳15分钟，直至温度达到55摄氏度。

将所有样品与甲酰胺染料在85摄氏度下加热5分钟。然后，将每个样品取1微升加样至6%聚丙烯酰胺测序凝胶上，在1500伏电压下电泳运行8小时。最后，使用基于荧光的成像仪实时读取条带。

该方法表明，RNA 的确认对于翻译起始复合物的形成至关重要。XIAP mRNA 核糖体复合物的反转录在 AUG 起始密码子下游 17 至 19 个核苷酸处产生典型的阻滞信号（toeprints）。5'PPT 突变体显示出阻滞信号形成的缺陷。

然而，在带有5'帽结构进行转录时，会形成起始复合物。类似地，3'PPT突变体也表现出趾印信号形成受损。然而，带有5'帽结构的转录可导致起始复合物的形成。

同时携带5'PPT和3'PPT突变的双PPT突变体能够在无5'帽结构的情况下形成起始复合物。在缺乏RRL、GMP-PNP和poly A尾的情况下，起始密码子突变体的趾印信号形成受到显著抑制。将cDNA产物与双脱氧核苷酸测序梯进行比较。

人β珠蛋白（human beta globin）或HBB mRNA在缺乏5'帽结构时不会出现趾印（toeprint）信号。然而，在带有5'帽结构的HBB 5'非翻译区（5'UTR）上可形成起始复合物，产生位于AUG起始密码子下游16至18个核苷酸处的趾印信号。若操作得当，掌握该技术后可在三天内完成，包括体外转录模板和RNA的制备。

完成此操作后，还可进行其他方法，例如结构探针实验，以回答更多问题，如IRES的野生型或突变体变体的二级结构。该技术建立后，为mRNA翻译领域的研究人员探索IRES介导的体外翻译铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何对哺乳动物mRNA进行阻滞测序（toeprinting），以及如何分析翻译起始复合物的形成。

请勿忘记，酸性酚、酚:氯仿:异戊醇和丙烯酰胺可能具有极高危险性。使用这些试剂时应穿戴适当个人防护装备。