使用 MeshAndCollect 解析荧光蛋白 Cerulean 的结构

自动化的MeshAndCollect方案被开发用于将序列晶体学与标准旋转数据收集相结合，以测量从样品环上分离的小晶体。该方法首先确定安装在同一样品架上的晶体位置，然后指导收集部分数据集，这些数据集随后将被合并并用于结构解析。MeshAndCollect的优势在于，它允许您使用相同的实验设置快速完成实验，包括结构解析、配体筛选等，且仅需极微小的晶体即可实现。

该方法最适合用于配备高光子通量、小光束直径和快速重载探测器的同步辐射光束线VMX。首先，连接至蛋白质晶体学光束线数据库的扩展信息系统，并选择MX。使用A表单中的实验编号和密码登录。然后，选择“样品 shipment 添加新条目”并填写所需信息。

选择添加部分并填写相关数据。选择添加容器，选择一个SC3载物盘，并填写所需信息，包括样品架在载物盘中的位置。在实验舱内，将载物盘装入样品更换器门中，并记录其位置。

接下来，登录蛋白质晶体学光束线数据库的信息系统。选择“准备实验”，找到货件，点击“下一步”，并在样品交换器中指明光束线和样品托盘位置。使用A表上提供的实验编号和密码登录光束线控制软件。

按“同步”以将光束线控制软件与蛋白质晶体学光束线数据库的信息系统同步。使用光束线控制软件将样品托架安装到测角仪上。然后在样品更换器区域中右键单击一个位置，并选择“安装样品”。

选择中心按钮，然后在环状针尖边缘的中点处点击三次以进行居中。通过选择“保存”来保存居中位置。在“高级”选项下，将工作流程“视觉重定向”添加到数据采集队列中。

然后通过单击“Collect Queue”启动工作流程。接下来，通过单击选择一个已保存的中心位置。再次单击“center”按钮，然后在环状结构起始部分的中点进行三次点击以确定中心。

单击“保存”以保存第二个位置，然后单击“继续”。在工作流程将样品台平面与测角仪的旋转轴对齐后，再次将样品台中心置于网格中央的某个位置。

使用光束线控制软件旋转 ω 轴，调整样品架方向，使网格面与 X 射线束方向垂直。在光束线控制软件中，单击“光圈”下拉菜单并选择一个数值，然后单击网格工具图标，打开网格工具窗口。

在光束线控制软件的样品视图中，通过在样品托上含有晶体的区域按住鼠标左键并拖动来绘制网格。要保存网格，请点击网格工具窗口中的加号按钮。在光束线控制软件的分辨率字段中，输入应采集衍射图像的分辨率。

如果对晶体的衍射质量没有先验信息，建议选择 2 到 2.5 之间的数值。在高级数据收集选项卡中选择 MeshAndCollect。将其添加到队列中，然后点击收集队列。

在参数窗口中，使用与光束线相关的默认参数。在本实验中，默认参数为每次网格扫描点的曝光时间为 0.037 秒，透射率为 100%，每条网格扫描线振荡角度为 1 度。单击继续。

网格扫描运行后，使用软件 Dozer 分析在每个网格点收集的衍射图像，并根据衍射强度进行排序。Dozer 分析完成后，将生成热图，并根据衍射强度自动分配后续部分数据采集的顺序。最后，单击“继续”以启动部分数据采集。

在MXCuBE中实现的MeshAndCollect方法被用于收集位于同一样品托上难以通过肉眼识别的小尺寸天蓝蛋白（Cerulean）晶体的部分衍射数据集。为了对样品托进行筛选，在网格环中心绘制了一个网格，并根据Dozer评分热图自动收集了85个部分衍射数据集。这些数据集分别进行积分后合并，最终获得一套分辨率为1.7 Å、完整度达99.8%的数据集。

正如预期，Cerulean 的晶体结构可通过分子置换法利用所生成的数据集解析。经过结构精修后，得到 R_work 为 22.8%，R_free 为 25.4%。与先前测定的结构进行叠加比较，结果显示主链α碳原子的全局均方根偏差（RMSD）为 0.1 埃。

对于需要优化晶体生长阶段的项目，MeshAndCollect 提供了一种可能性，即通过整合从小晶体获得的这些非晶态部分数据集，来获取完整的数据集。该技术为结构生物学家开辟了新途径，使其能够利用仅能产生少数微晶的样品来解析结构。