用于蛋白质纯化的聚(五氟苯基丙烯酸酯)功能化 SiO₂ 微球的制备

该方法可用于制备生物分子活化表面，在药物递送、生物靶标检测和生物分离等领域具有应用价值。该技术的主要优势在于聚PFPA刷对胺类具有高反应活性，抗体的固定化仅需在缓冲溶液中孵育数小时即可完成。该技术的应用前景包括通过免疫纯化实现蛋白质纯化，因为固定的抗体能够成功结合目标抗原。

尽管本方法以抗体动员和蛋白质纯化为例进行演示，但也可应用于其他需要生物大分子动员的系统。对二氧化硅微球进行APTES处理时，首先获取浓度为5%（重量/体积）的水悬浮液形式的二氧化硅颗粒。取0.8毫升二氧化硅悬浮液，加入40毫克APTES和8毫升甲醇，混匀于一个装有搅拌子的20毫升闪烁瓶中。

在室温下剧烈搅拌反应液，持续五小时。五小时后，将溶液转移至锥形管中。为分离APTES功能化的二氧化硅微珠，以10,000 G离心五分钟。

然后去除上清液。现在用三毫升新鲜甲醇重新分散珠子进行洗涤。用手轻轻振荡试管以混匀，如有必要，可在水浴中超声数秒以改善分散效果。

同前离心，并重复洗涤步骤一次。将甲醇洗涤后的二氧化硅珠与三毫升二甲基亚砜（DMSO）混合。手动振荡混合物，或必要时超声数秒，直至珠子在 DMSO 中完全分散。

离心后，弃去上清液。再次进行一次离心操作，以确保溶剂从甲醇完全置换为DMSO。制备聚PFPA溶液时，将20毫克聚PFPA溶解于2毫升DMSO中，置于20毫升闪烁瓶内。

配制 PEG 溶液时，将氨基功能化的 PEG 溶解于 1 毫升 DMSO 中。然后将 PEG 溶液转移至聚 PFPA 溶液中，在室温下剧烈搅拌反应一小时。

将1毫升悬浮于DMSO中的APTES功能化二氧化硅微球转移至PEG取代的聚PFPA溶液中。在室温下剧烈搅拌反应1小时，使聚PFPA与APTES功能化二氧化硅微球发生接枝反应。随后在10,000 G离心5分钟分离微球，并去除上清液。

加入三毫升二甲基亚砜（DMSO）洗涤磁珠，手动混匀或短暂超声处理几秒钟。按前述方法离心磁珠，弃去上清液后，重复DMSO洗涤两次。

用三毫升三蒸水再洗涤磁珠两次。然后手动混合或超声处理几秒钟。按前述方法离心磁珠，并移除上清液。

最后将珠子置于真空烘箱中，在40摄氏度下干燥过夜。取5毫克聚PFPA接枝的二氧化硅珠子，加入至1.5毫升微量离心管中。加入800微升PBS洗涤珠子，并通过涡旋充分混匀。

在室温下以 10,000 G 离心 beads 一分钟。弃去上清液，并重复洗涤步骤三次。然后加入 350 微升新鲜 PBS、50 微升 0.1% PBST 和 6.67 微克抗体。

在4°C条件下于旋转仪上孵育约20小时。第二天，洗涤磁珠，并在400 ×g、4°C条件下离心1分钟。然后弃去上清液，小心加入400 µL裂解缓冲液。

用移液器轻轻吹打5次，使磁珠重悬。重复此洗涤步骤3次。最后一次洗涤后，尽可能吸除上清液。

按照文字方案所述准备细胞和裂解缓冲液。然后用400 µL裂解缓冲液重悬细胞沉淀。使用超声波破碎仪对细胞进行超声处理。

超声处理后，短暂涡旋振荡。然后在4°C条件下以20,000 G离心10分钟。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。

进行免疫沉淀时，将300微升细胞裂解液转移至预先制备的抗体固定化聚PFPA接枝二氧化硅微珠中。另取30微升细胞裂解液作为输入样本，保留在新的微量离心管中。将裂解液与微珠混合物置于4摄氏度旋转仪上孵育三小时。

孵育结束后，将混合物在4 °C条件下以400 ×g离心1分钟。弃去上清液，小心加入400 µL洗涤缓冲液。用移液器轻轻吹打约5次，使磁珠充分重悬。

经过三次洗涤后，尽可能吸除上清液。向珠子和输入样品中加入30微升2x SDS上样染料，然后在95摄氏度下加热10分钟。

加热后，使用蛋白质印迹法分析样品，或在-20摄氏度下保存样品。通过X射线光电子能谱（XPS）检测功能化二氧化硅珠，以确定其表面组成。此处展示了典型的XPS数据。

经APTES处理后，可检测到与APTES分子中胺基团相关的氮1s峰。经聚PFPA处理后，可检测到与聚合物上PFP单元相关的氟1s峰。通过免疫沉淀法富集蛋白激酶RNA激活剂（PKR），并对富集的蛋白质样品进行Western印迹分析。

正如预期，未固定抗体或使用非特异性抗体混合物的磁珠未富集到PKR。与抗PKR抗体孵育的磁珠能够成功富集PKR，这通过PKR条带的存在以及GAPDH条带的缺失得以证实。在进行该实验时，需要注意的是，在比较不同体系时，免疫沉淀实验以及后续的蛋白质印迹分析应同时进行。

该技术开发完成后，可用于固定不同的生物分子或材料底物。此外，该方法还具有额外优势，即可仅调节表面特性，以满足不同应用的需求。