利用流式细胞术追踪miRNA向细胞外囊泡的释放

我的实验室致力于研究微小RNA（microRNA），几十年来我们已知微小RNA在癌症中会减少。然而，这些微小RNA是如何丢失的机制一直未被充分阐明。我们近期关于细胞外囊泡的研究表明，在癌症中减少的微小RNA正被主动装载进这些细胞外囊泡中。

我们目前的目标是深入探究在肿瘤发生过程中，这些RNA如何被主动装载到细胞外囊泡中的机制。本方案有助于理解并捕捉microRNA向细胞外囊泡释放的动态过程，这是细胞外囊泡生物学研究中具有挑战性的领域之一。我们的研究结果为推进调控癌症中microRNA耗竭通路的研究提供了有力工具。

我们计划通过细胞外囊泡研究特定 microRNA 亚群缺失所导致的功能性和表型效应。一旦确定了参与将这些 microRNA 装载到细胞外囊泡中的相关因子，我们的目标便是下调这些因子并评估其表型后果。此外，由于我们已鉴定出这些小RNA中包含的一个基序，我们希望探究该基序是否足以且必需介导这些RNA向细胞外囊泡中的装载。

首先，取转染了荧光团标记的细胞外囊泡microRNA（EV-microRNA）和细胞microRNA的Calu-6细胞。将细胞悬液通过附带于圆底聚苯乙烯FACS管上的35微米滤网帽进行过滤。然后准备流式细胞仪，打开仪器电源，使用前预热30分钟。

使用鞘液对流体系统进行预冲洗。随后，验证并调整激光对准。进行质量控制时，将超纯过滤水加入流式细胞仪，在适当的流速下运行，并确保足够的采集时间。

然后将 Calu-6 细胞信号捕获的阈值设为 FSC 5,000。为校正荧光染料之间的光谱重叠，需使用未转染的细胞以及仅转染单一荧光染料的细胞制备补偿对照。在转染细胞中进行表达分析时，FSC、SSC、FITC 和 PE 通道的电压分别设置为 258、192、269 和 423 单位。

然后将阴性对照样品引入流式细胞仪。在自定义工作表中设定FSC和SSC强度后，捕获细胞信号。在图中选择FSC作为x轴，SSC作为y轴。

围绕目标细胞群绘制多边形，以在坐标轴上创建门控。要使用已门控的细胞群创建新图，将 x 轴设置为用于细胞内 microRNA 检测的荧光信号一，y 轴设置为用于细胞外囊泡（EV）microRNA 检测的荧光信号二。利用分别转染了不同荧光标记 microRNA 的细胞，确定各荧光染料的补偿参数。

对转染了细胞microRNA和EV-microRNA的细胞进行流式细胞术分析，结果显示对应于EV-microRNA的荧光信号呈逐步减弱趋势。相比之下，对应于细胞microRNA的信号在细胞中得以保留，表明荧光标记物不影响细胞对microRNA的保留能力。首先，取经荧光标记的EV-microRNA和细胞microRNA转染的Calu-6细胞所分离出的细胞外囊泡（EVs）。

用适量超滤 PBS 稀释 EVs，以制备用于流式细胞术分析的细胞外囊泡悬液。使用纳米流式细胞仪分析纳米级颗粒。启动软件，并根据推荐的校准说明对仪器进行配置。

使用性能纳米微珠进行性能测试。若纳米微珠的检测结果处于标准尺寸范围内，则认为仪器性能处于最佳状态。确定适用于EV颗粒检测的合适流速。

现在使用超纯过滤水进行质量控制检查，以验证仪器的流体系统，并评估检测器和激光器的性能。根据制造商的说明书设置参数，以评估微球混合物中不同群体的灵敏度和分辨率。然后应用适当的设门方法，将微球群体与仪器噪声区分开来。

接下来，充分涡旋振荡样品，以确保细胞外囊泡（EVs）均匀分布，然后上样进行分析。启动流式细胞术数据分析软件，并引入超滤的 PBS。使用超滤的 PBS 设置针对 EV 颗粒的门控，确保门控范围与基于校准结果所确定的颗粒大小相匹配。

取已转移并涡旋混匀的EVs，将其加入适用于Attune仪器的离心管中，然后将该管装入仪器。在x轴绘制FSC、y轴绘制SSC的图中捕获EV信号。对于细胞microRNA检测，x轴选择荧光信号一；对于EV microRNA检测，y轴选择荧光信号二。

利用转染单一微小RNA后分离得到的细胞外囊泡（EV）样本，建立荧光染料的补偿参数。流式细胞术结果显示，EVs中miR-451a Alexa Fluor 488的荧光信号随时间依赖性积累，表明其被有效包装并释放；相比之下，细胞内的miR-67在EVs中未检测到荧光信号。