木蛀甲虫附肢的扫描与透射电子显微镜样品制备方法

钻木甲虫的体表在扫描电镜下通常显得坚硬。在固定液和洗涤液中加入Tween-20。在透射电镜中，Tween-20可增强固定液对虫体体壁的渗透，从而更好地固定体内组织和器官。

荧光显微镜有助于提高切片的准确性。该技术有助于清洗蛀木甲虫体表并穿透其体壁，从而可获得更清晰的扫描电镜和透射电镜图像。

荧光显微镜有助于提高透射电镜（TEM）切片的准确性。本实验操作将由本实验室的研究生张 Yanru 演示。在天牛虫（Chlorophorus caragana）分布区域，使用含有异佛尔酮等植物引诱剂的漏斗型诱捕器进行野外诱捕。

将钻木甲虫成虫诱捕至陷阱中。将成虫花天牛（Chlorophorus caragana）的洁净虫体置于 pH 7.2 的 0.1 摩尔/升 PBS 缓冲液中，加入终浓度为 2.5%（体积分数）的戊二醛和 0.06%（体积分数）的吐温-20 进行固定。于 4°C 条件下固定三天。

将标本从保存液中取出，并用 PBS 冲洗。在体视显微镜下，使用镊子去除附肢，并在 PBST 中以 40 千赫兹进行超声波清洗。清洗 100 秒后，将样品转移至显微镜下检查是否已清洁干净。

清洗时间不得超过400秒，以免造成损伤。然后将样品依次浸入不同浓度的乙醇中，每种浓度处理20分钟，以完成脱水。脱水后，在体视显微镜下，使用碳双面导电胶带将背侧、腹侧和侧侧三个观察面分别固定在样品台上。

确保所有观察表面保持清洁且无污染。将样品台放入含有硅胶干燥剂的培养皿中，干燥48小时。随后，在离子溅射仪上将主阀旋转至打开位置，取下样品室盖，将样品放入样品室中。

打开电源开关，并确保就绪指示灯亮起。将溅射时间设置为45秒，镀层厚度设置为70.875埃。当机械泵真空表指针降至7以下时，按下放电按钮并开始喷镀铂。

实验结束后，关闭电源，将样品从腔室中取出。计算喷雾薄膜厚度 D（单位为埃），公式为 D 等于 K 乘以 I 乘以 V 乘以 T。其中，K 是由溅射金属和气体决定的常数；I 为等离子体电流，单位为毫安；V 为施加的电压，单位为千伏；T 为时间，单位为秒。

将含有样品的样品台插入扫描电镜（SEM）的样品台上。确保带样品台的样品台具有足够的高度，以获得良好的图像。打开扫描电镜软件，并选择所需的加速电压，起始电压为 20 千伏。

从成年花天牛（Chlorophorus caragana）获取附肢后，将样品置于PBST中，在超声波清洗仪中清洗3小时，随后在25摄氏度下用含1%（质量/体积）四氧化锇的PBS溶液后固定1小时。在室温下，依次使用体积分数为50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%和100%的乙醇溶液进行脱水处理，每步20分钟。用镊子将加热的树脂涂抹于平底包埋模具中，并将样品包埋于树脂内。

确保样品位于孔板底部，并尽可能靠近凹槽边缘。标记后，将含有样品的孔板在60摄氏度下孵育72小时。孵育结束后，从孵育箱中取出孔板，确认树脂已聚合。

待样品凝固后，将每个树脂块置于荧光显微镜下，调整显微镜的荧光光源，使其从上方以蓝光照射样品并拍照。确保树脂块中的感器清晰可见。测量树脂块边缘与目标传感器之间的距离，以准确定位感器。

参考触肢的扫描电镜图像，用剃刀片将树脂块大致切割至接近目标感受器的位置。接着，在蓝光荧光显微镜下，调节上方光源，使感觉毛清晰可见。将目镜测微尺置于荧光显微镜载物台上。

拍摄粗切的树脂块照片，然后使用 ImageJ 测量目标位置与树脂边缘之间的距离。将树脂样品置于超薄切片机上，切割 50 至 60 纳米厚的切片，直至到达目标位置。将切片捞取至培养皿中载有聚乙烯醇支持膜的 100 目铜网上。

在室温下使用过滤的饱和醋酸铀酰溶液对载网进行染色。染色过程中应覆盖样本，以防止光照产生沉淀。染色时间为10分钟。

在通风橱中，先用50%甲醇冲洗两次，再用过滤除气的水冲洗两次。将制备好的柠檬酸铅染液滴加在塑料培养皿的方格上，静置八分钟。然后用除气的过滤水冲洗并干燥。

将载网安装到透射电镜（TEM）仪器的样品台上。设置电压为80千伏，观察切片。在本实验方案中，使用含Tween-20的清洗和固定溶液处理后，所获得的扫描电镜（SEM）图像比未使用Tween-20的样品更清晰。

使用Tween-20固定液可使戊二醛固定液充分渗透组织，透射电镜图像中微管结构清晰可见，而未使用Tween-20制备的样品内部结构则模糊不清。对下颚须上一类棒状刺感器小枝的连续横截面观察显示，树突鞘包绕外树突节段，并延伸至顶端孔。在被外腔包围的内受体淋巴腔内，存在七根无分支的外树突节段。

管状体在每个感觉器窝基部由树突鞘与其他外部树突节段分隔开。在纤毛区域，观察到八条直径不同的树突，表明存在八个双极神经元。该技术可用于进一步研究神经功能，例如单细胞记录或原位杂交。