扫描电镜（SEM）用于难处理的植物、卵菌和真菌样品的实验方案

本方法学的目标是对植物、卵菌和真菌的 delicate 组织进行处理，以实现其在扫描电子显微镜（SEM）下的最佳观察。该方法有助于回答有关各类真菌、微生物、形态特征，以及它们如何侵染、定殖和附着于宿主的问题。我们改进后的方法学技术适用于样本的固定，尤其适用于水生生态系统中微生物的研究。

该技术的主要优势在于，它使我们能够利用成本较低且易于获取的资源来观察感染过程中的关键方面。本方法的可视化演示至关重要，因为其操作步骤相较于传统方案已进行了大量修改，而已发表的方法通常仅描述了大致流程，缺乏细节。

首先，在配备醛类过滤装置的通风橱内配制福尔马林-乙酸-乙醇（FAA）固定液。配制比例为：85份70%变性乙醇、10份60%甲醛溶液和5份冰醋酸。在通风橱内，将FAA储备液分装至各个容器中。

选择要固定的花芽或营养分生组织，确保其未受到昆虫、真菌或极端天气条件的损伤。剪下枝条，去除不需要的组织，并立即将样品放入FAA固定液中。72至96小时后，将FAA溶液倒入塑料容器中进行化学废弃物处理。

立即用新鲜的70%乙醇将样品清洗三次，以去除任何残留的FAA。固定后的材料可无限期地保存在70%乙醇中。将样品解剖至盛有乙醇的培养皿中，以防止组织干燥。

使用培养皿，其底部覆盖一层干燥的黑色硅胶，以便更清楚地观察呈对比色的白色组织。将组织转移至不同的容器中，然后将其浸入盛有70%乙醇的培养皿内。盖上容器盖子，并将其放入装有足量70%乙醇的塑料离心管中。

将解剖后的材料通过密封罐或离心管中的乙醇系列进行转移。每种溶液中至少放置一小时。然后在100%乙醇溶液中过夜保存样品。

经过乙醇系列处理后，将装有材料的容器转移至临界点干燥仪（CPD）。在扫描电镜样品台下方写上样品编号。然后用双面胶带覆盖样品 stub 的顶部。

将样品 stub 放入样品台中。在体视显微镜下，小心打开盛有经临界点干燥（CPD）处理后已干燥的幼嫩样品的容器。需要注意的是，经过 CPD 处理后，样品会变轻且对静电敏感。

取出样品后立即关闭容器，以避免灰尘或杂质进入。将样品放置在载 stub 的粘性表面时，应提前规划好所需位置。一旦样品接触到表面，便很难再将其移除。

此时不要尝试进行大型解剖操作，只需去除容易拾取的多余组织即可。对于孢粉学研究，需解剖花药并将其打开，使花粉暴露在花药残端上。

将样品置于含硅胶的密闭容器中过夜保护，以防重新吸水。按照文本方案所述，使用喷点仪对样品进行镀膜处理，并将其转移至扫描电镜。为检测不同培养皿中囊胞刺突的差异性生长，将0.5毫升次级囊胞悬液分别接种到不同表面上。

表面可包括碳、金和铜的透射电子显微镜载网，以及先前使用的漂白三文鱼和无须鳕鱼鳞片和玻璃盖玻片。将包囊在20摄氏度下孵育70分钟，以促进包囊附着于表面。

吸去液体，向每个表面加入0.5毫升2%戊二醛以固定包囊。将样品置于通风橱内室温下保存1小时。去除戊二醛，并通过乙醇系列对样品进行脱水，每种乙醇溶液各加入5毫升，作用15分钟。

将样品置于最后一次的100%乙醇溶液中后，可在密封的培养皿中保存长达一个月。小心地将载网和标尺从培养皿转移至适合临界点干燥仪（CPD）使用的样品 holder 中，确保样品彼此分离，例如使用CPD专用载网 holder 或堆叠式样品 holder。使用镊子夹取载网和标尺时，应注意始终使包囊面朝上。

在进行卵母细胞的扫描电镜样品制备以观察其在不同表面上的行为之前，需按照文本方案中的描述，先使用临界点干燥仪（CPD）对材料进行干燥。将每个样品小心地用滤纸包裹，制成约0.5至1平方厘米大小的信封状，并用铅笔标记。注意不要压碎样品。

用回形针将滤纸封好。然后将封装好的样品转移至培养皿中，加入10毫升水浸泡，以使孢子周围的组织复水。立即将样品放入微波炉中。

一旦水开始蒸发，立即取出材料，并在室温下冷却。然后将样品通过乙醇系列进行处理。根据样品量的多少，此步骤可使用烧杯或离心管。

将样品在每种溶液中放置15分钟。接着，按照文本方案中的描述将样品放入CPD中。为进行扫描电镜观察而制备孢子时，打开信封。

然后用载 stub 的黏性表面收集孢子，注意不要压碎。最后，按照文本方案中的详细步骤对样品进行镀金处理并进行扫描电镜观察。图中所示为经四氧化锇处理并采用本视频演示的 FAA CPD 方案制备的刺果毛茛花蕾。

图中还展示了未经任何处理的赫氏菲罗里尼亚菌（phellorinia herculanea）干燥样本，以及按照本视频所示方法处理的真菌孢子。该图显示了在扫描电镜（SEM）下观察到的花器官早期、中期和晚期发育阶段。此图像为幼嫩再分裂花序（reh-cim）的顶面视图。

图中显示的是雌蕊群分化期间的花芽以及开花期的花朵。某些结构在扫描电镜成像前的固定和保存过程中可能较为困难。例如来自湿润环境的样品，以及具有装饰性结构或毛被的样品。

图中展示了寄生水霉（Saprolegnia parasitica）在玻璃、碳、铜、金、无须鳕鱼鳞和鲑鱼鱼鳞表面的菌丝差异性生长模式。本视频展示了寄生水霉的无性生命周期。无性生命周期对于这些生物在水生或潮湿环境中的扩散至关重要。

此外，此阶段产生的水霉类寄生物种的游动孢子是感染的主要单位。虽然掌握该技术可在三到五天内完成，但必须正确操作。我们在马德里皇家植物园利用经费完成了用于此时间段内外部使用的扫描电镜（SEM）处理。

观看本视频后，研究人员将了解如何有效采集并固定用于扫描电镜（SEM）观察的精细生物材料。通过该方法，可轻松克服细胞破坏、器官变形或来自湿润环境样本保存不良等问题。在进行该操作时，需注意扫描电镜观察仅限于对表面进行高倍放大研究。

在进行CPD处理之前，还必须确保样品密封，避免受到剧烈的环境变化以及与空气的直接接触。该技术发展之后，为植物学领域的研究人员探索孢子在感染过程中的结构特征铺平了道路，尤其是在与渔业相关的物种中。完成此操作后，还可进一步采用其他方法，如透射显微镜（TM），以回答更多问题，例如特定器官或细胞、花粉中细胞组成的内部结构是怎样的。

请务必注意，操作甲醛和戊二醛可能具有极高危险性，进行本实验操作时，必须采取防护措施，例如在通风橱内操作，并佩戴口罩、实验服和手套。