用于顺序分子递送的微尺度涡流辅助电穿孔仪

本实验的总体目标是利用涡流辅助微流控穿孔装置，以高效率、可控制剂量且按顺序递送多种具有生物学意义的分子。该目标的实现首先需要准备四个50毫升离心管，每个离心管中分别含有细胞和生物分子的DPBS溶液，并将每个离心管连接至与气动流控系统相连的相应小瓶架上。第二步是将各个小瓶的进样管插入含有15针电极的微流控装置中。随后，细胞被引入装置，并被捕获在电穿孔室中形成的微尺度涡流内。

最后一步是立即对捕获的细胞施加短暂的电脉冲，随后注入含有待递送生物分子的溶液至细胞质中。最终，可将此过程获得的细胞释放并收集，用于后续分析。该技术相较于现有方法的主要优势在于，能够以高效率和高细胞存活率，将精确控制的多种分子依次递送至预先选定的相同细胞群体中。

该方法的可视化演示至关重要，因为液体交换步骤的学习难度较大，尤其在每种溶液中冷流步骤的时间控制上。切换步骤的时机决定了细胞捕获的稳定性。本实验将使用一种转移性乳腺癌细胞系 M-D-A-M-B 231，在 T75 组织培养瓶中以每毫升 1×10⁵ 个细胞的密度接种，总体积为 10 毫升，培养基为添加了 10%（体积比）胎牛血清和 1% 青霉素的 Leibovitz L-15 培养基。

链霉素 在37摄氏度、0%二氧化碳的湿润培养箱中孵育细胞。接种后两天，收集细胞用于实验。用布科氏磷酸盐缓冲液（Bukos PBS）或DPBS洗涤细胞后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理细胞两分钟。

加入8毫升培养基以终止酶活性，通过在200 × g条件下离心5分钟使细胞沉淀，然后将细胞重悬于培养基中，最终浓度为每毫升5 × 10⁵个细胞。本视频中不展示微流控电穿孔装置的设计与制备过程，相关内容详见随附的论文。该系统包含细胞、分子以及冲洗溶液的进样口。

两个用于发生惯性聚焦的直通道。10个带有电极和出口的电穿孔腔室，用于建立流动实验。将出口、聚醚醚酮（PEEK）管以及用于短脉冲高电压施加的15针铝电极通过微通道中的孔洞插入指定位置。

15针电极包含10个正极和5个负极。每个正极与负极之间的间距为1.5毫米，相同极性的电极之间间距为1.35毫米。将用于产生高压短方波脉冲的电气设备连接至与流动溶液接触的铝制电极。

在PDMS模具中，设备应包括一个脉冲发生器和一个自制的高压放大器。准备四个50毫升离心管，分别装入DPBS以及含有细胞和分子的溶液。将每个离心管连接至与其对应的、连接到气动流量控制系统的小瓶架上。

将进样峰管路从样品瓶架连接至微流控装置上相应的进样孔。接着，设置方波脉冲电压的幅值为100伏特。

为了使电穿孔室中的电场强度达到0.7千伏/厘米，将压力调节器设置为40 PSIA。使用一个可手动调节的单一氮气源，均匀地对所有样品管加压，并利用高速歧管及时激活各个溶液通道。通过定制的LabVIEW软件控制阀门。

打开标记为“valve runner”的实验室视图软件，点击下拉菜单“Operate”中的“run”选项。点击相应的阀门图标“valve one”，打开DPBS储液罐的阀门，以启动所需的流速，用于稳定细胞捕获涡流的生成，持续1.5分钟。在细胞捕获步骤之前，同时流过洗涤液和细胞溶液，清洗装置10秒，此时阀门图标应由灰色变为绿色，表示流体已激活。

为确保在溶液切换步骤中流动不中断，应在每次溶液切换时重复此短暂的共流步骤。将正在使用的溶液通道从清洗液切换至细胞溶液，以在电穿孔室中捕获细胞，持续30秒。在本视频中，蓝色荧光信号代表有活力的钩状结构。

3、3、3、4、5 阶段细胞。打开清洗口并冲洗装置 20 秒。为了去除未被捕获的污染细胞，流过含有第一个目标分子的溶液。

为了可视化目的，将碘化丙啶注入装置中。在本实验中，使用核酸染料代替荧光标记的 DExT 链段，因为染料具有更优的信噪比；在分子溶液注入后立即施加五个短脉冲，并使用示波器实时监测所施加电脉冲的幅度和数量，可在显微镜下观察到分子的荧光信号；将细胞在分子溶液中孵育 100 秒。接下来，将含有第二种分子的溶液，即核酸染料 YoYo-1，流入装置中。

在此演示中，第二种分子的递送无需额外施加电脉冲。该视频证实细胞现在表达了全部三种荧光信号：yo-yo 标记绿色，碘化丙啶标记红色，hooks 标记蓝色。

3, 3, 3, 4, 5. 通过将操作压力降至5 PSI以下，将细胞释放至96孔板中，用于后续分析。每次释放可从每个孔收集约100个细胞的溶液，体积约为100 µL。

必须至少重复电穿孔步骤三次，以收集足够用于流式细胞术离心的细胞。将含有处理后细胞的96孔板在228 ×g 条件下、室温离心五分钟。随后移除含有过量荧光分子的上清液，并用DPBS重悬细胞。

若递送了荧光标记的DExT链，则随后通过流式细胞术分析细胞对分子的摄取效率。通过监测C二孔中电穿孔后悬浮细胞荧光强度的变化，可定性判断分子递送是否成功，结果证实90%经处理的细胞摄取了70,000道尔顿的阴离子DExT链分子。

每种转染的葡聚糖分子的效率定义为成功摄取目标分子的细胞数与处理的总细胞数之比，该效率不随分子量或电荷性质发生显著变化。所有测试的葡聚糖分子均以超过70%的效率递送至细胞质中。此处显示的是未经电穿孔处理的细胞的代表性流式细胞术图谱。指示成功分子递送的荧光阈值根据数据设定，使得对照样本的信号均低于该阈值。

此代表性流式细胞术数据显示了依次电穿孔细胞的流式图谱及其相邻的荧光条带图像，绿色方框代表仅摄取3000道尔顿中性葡聚糖的细胞信号，红色方框代表仅摄取3000道尔顿离子化DExT链的细胞信号，而黄色区域显示同时摄取两种DExT链分子的细胞荧光信号，表明双分子递送效率为56%。该技术开发后，将有助于医学、生物技术和药理学领域的研究人员探索治疗试剂的联合使用，以在治疗复杂疾病时实现协同效应。

请注意，使用高压电脉冲操作可能极为危险，在进行该实验步骤时，应始终采取必要的预防措施，例如确保自身接地。